免疫毒素与检查点抑制剂的组合治疗制造技术

区域性、肿瘤靶向的细胞毒素疗法例如D2C7‑免疫毒素(D2C7‑IT)不仅特异性靶向并破坏肿瘤细胞，而且在该过程中引发促进原位疫苗效应的免疫事件。通过免疫检查点阻断来扩增抗肿瘤作用，这产生了有效消除所有肿瘤细胞的长期全身性免疫响应。

Combination therapy of immunotoxin and checkpoint inhibitor

The regional and tumor targeted cytotoxin therapy, such as the D2C7 IT (IT), not only specifically targets and destroys tumor cells, but also induces immune events that promote the effect of the in situ vaccine in this process. Anti-tumor effects were amplified by blocking immune checkpoints, which produced a long-term systemic immune response that effectively eliminated all tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】免疫毒素与检查点抑制剂的组合治疗本专利技术在国立卫生研究院授予的CA197264和CA-154291政府支持下完成。政府对本专利技术享有一定的权利。
本专利技术涉及免疫治疗领域。具体地，其涉及治疗肿瘤的组合方案以及用于完成它们的试剂盒和药物。
技术介绍
胶质母细胞瘤是所有原发性脑肿瘤和中枢神经系统肿瘤中最恶劣的恶性脑肿瘤。目前标准治疗或甚至新开发药物治疗的胶质母细胞瘤患者的中位存活时间少于15个月。因此，迫切需要开发先进和有效的治疗方法以改善胶质母细胞瘤患者以及其它表达EGFR受体的肿瘤的不良存活前景。
技术实现思路
根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于治疗患者肿瘤的方法。向患者施用免疫毒素和免疫检查点抑制剂。该免疫毒素包含与PE38截断的假单胞菌外毒素融合的单链可变区抗体。该单链可变区抗体具有如SEQIDNO：6-11所示的CDR1区、CDR2区和CDR3区。根据本专利技术的另一方面，提供了一种用于治疗肿瘤的试剂盒。该试剂盒包含免疫毒素和免疫检查点抑制剂。该免疫毒素包含与PE38截断的假单胞菌外毒素融合的单链可变区抗体，其中，该单链可变区抗体具有如SEQIDNO：6-11所示的CDR1区、CDR2区和CDR3区。在阅读说明书后对本领域技术人员显而易见的这些和其它实施方式为本领域提供了用于治疗胶质母细胞瘤和表达表皮生长因子(EGF)受体(即EGFR以及其突变体(例如EGFR变体III))的其它肿瘤的治疗方法、方案、试剂盒和试剂。附图说明图1.区域细胞毒素疗法和免疫检查点阻断组合的可能机制。细胞毒素疗法可能导致原发性肿瘤的靶向破坏和“原位疫苗”效应。同时阻断免疫检查点受体PD1、PD-L1、TIM-3、LAG-3和/或CSF-1R可以增强疫苗介导的免疫。APC：抗原呈递细胞；PD1：程序性死亡分子1；PD-L1：程序性死亡配体1；TIM-3：T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3；LAG-3：淋巴细胞活化基因-3；CSF-1R：集落刺激因子1受体；NK/NKT：自然杀伤细胞/自然杀伤T细胞。图2A-2DCT-2A-mD2C7细胞系的流式细胞术分析。(图2A)小鼠H-2Kb(MHCI类)表达，(图2B)小鼠H-2Db(MHCI类)表达，(图2C)小鼠PD-L1表达和(图2D)D2C7-IT靶抗原mEGFRvIII在CT-2A-mD2C7细胞上的表达。图3D2C7-IT对CT-2A-mD2C7细胞的体外细胞毒性。使用WST1测定来确定D2C7-IT对CT-2A-mD2C7细胞的体外细胞毒性。与阴性对照免疫毒素P588-IT(上线，IC50＞1000ng/ml)相比，D2C7-IT对CT-2A-mD2C7细胞的IC50为0.47ng/ml(下线)。图4.用CT2A-mD2C7细胞颅内注射的C57BL/6小鼠的存活。图5A-5B.免疫细胞填充CT2A-mD2C7脑肿瘤微环境的表型谱。图5A为对照脑并且图5B为CT2A-mD2C7肿瘤。(F480lo+F480int+F480hi)＝巨噬细胞。图6.D2C7-IT、BLZ945组合治疗的实验大纲。图7.D2C7-IT和BLZ945组合疗法对颅内CT2A-mD2C7神经胶质瘤模型的抗肿瘤功效。图8A-8B.D2C7-IT+(αCTLA-4或αPD-1)mAb组合疗法在皮下携带CT2A-mD2C7神经胶质瘤的C57BL/6免疫活性小鼠中的体内功效。图8A显示了所有治疗组随访直到第35天。图8B显示了在初始肿瘤接种后随访直至第62天的治疗组G4-6。注意到10只小鼠中的4只和10只小鼠中的5只分别在治疗组G5和G6中治愈。图9A-9B.对于组合治疗组(G5和G6)中治愈小鼠的肿瘤再激发研究。图9A.首先在第72天用106个CT2A亲代细胞在左侧翼再激发治愈小鼠。图9B显示了在右侧翼的初始CT2A-mD2C7细胞接种后第126天用3×105个CT2A-mD2C7细胞在脑中进行的随后激发。在所有幼稚小鼠(G0)中有肿瘤生长，而在治愈的那些小鼠(G5和G6)中没有肿瘤生长。图10A-10B.D2C7-IT+(αCTLA-4或αPD-1)mAb组合疗法在双侧皮下携带CT2A-mD2C7神经胶质瘤的C57BL/6免疫活性小鼠中的体内功效。图10A显示了右侧(治疗过的)肿瘤的肿瘤生长曲线，这与先前的单侧模型相似。图10B显示了左侧(未治疗的)肿瘤的肿瘤生长曲线，这表明右侧的组合疗法对远处的左侧肿瘤也具有抗肿瘤作用。图11A-11B.在初始肿瘤接种后的第35天和第43天，在各组中的左侧肿瘤体积。图11A.在第35天，与治疗组G1相比，在所有其它治疗组中左侧肿瘤生长显著延迟，对于治疗组G2、G3和G4，p＜0.05；对于治疗组G5和G6，p＜0.01。图11B.在第43天，与对右侧肿瘤的D2C7-IT单一疗法相比，组合治疗显著延迟了左侧肿瘤生长，p＜0.05。具体实施方式本专利技术人通过将来自D2C7单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)与假单胞菌外毒素A(PE)融合(任选地与KDEL肽融合)而开发了靶向免疫毒素(IT)D2C7-(scdsFv)-PE38KDEL(D2C7-IT)。D2C7-IT与野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)和EGFR变体III(EGFRvIII)(两种在胶质母细胞瘤中过表达的蛋白)两者反应。D2C7-IT的强大抗肿瘤功效通过PE在免疫受损小鼠的原位神经胶质瘤异种移植模型中介导。除了直接杀死肿瘤细胞之外，免疫毒素单一疗法通过接合T细胞诱导继发性抗肿瘤免疫响应。当免疫毒素以免疫检查点抑制剂组合的方式施用时，观察到改善且协同的结果。可以与抗体连接的其它部分包括提供额外有益性质的部分。例如，可以在蛋白的羧基端添加KDEL(lys-asp-glu-leu)四肽以提供在内质网中的滞留。也可以使用类似功能的DKEL、RDEL和KNEL等变体。可以治疗的肿瘤是与D2C7抗体反应的任何肿瘤。这些肿瘤包括但不限于存在至少一种EGFRvIII等位基因的那些肿瘤。这些肿瘤可以在乳房、头部和颈部、脑、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、肺或其它肿瘤中发现。在疗法之前可能需要确定这种等位基因的存在。这可以使用基于寡核苷酸的技术(如PCR)或使用免疫学技术(如免疫组织化学)来完成。可能需要确定表达EGFR和/或EGFRvIII的肿瘤中细胞的量、分数、比例或百分比。在其表面上表达EGFR的细胞越多，这种抗体疗法可能就越有益。由于抗体结合野生型EGFR的能力，甚至可以治疗表达很少或不表达EGFRvIII的肿瘤。任选地，可以在治疗之前测试肿瘤与D2C7抗体的反应性。免疫毒素本身可以在治疗前、治疗期间或治疗后用作免疫组织化学试剂。第二试剂可以与免疫毒素一起用于检测。例如，它可以识别免疫毒素的假单胞菌组分。免疫毒素可以通过本领域已知的任何技术施用。为了避免表达EGFR的正常组织的细胞毒性，可能需要隔室呈递。合适的隔室呈递方法包括但不限于呈递至脑、呈递至手术创建的肿瘤切除腔、呈递至天然肿瘤囊肿以及呈递至肿瘤实质。可以通过本专利技术的方法治疗的肿瘤是表达表皮生长因子受体(EGFR)的任何肿瘤，无论是野生型、EGFRvIII还是其它变体。优选地，肿瘤以远远超过正常组织表达的量表达受体。高水平表达的机制可能是基因扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗患者肿瘤的方法，其包括：向患者施用免疫毒素，所述免疫毒素包含与PE38截断的假单胞菌外毒素融合的单链可变区抗体，其中，所述单链可变区抗体具有如SEQ ID NO：6‑11所示的CDR1区、CDR2区和CDR3区；以及向所述患者施用免疫检查点抑制剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.04 US 62/250,7491.一种治疗患者肿瘤的方法，其包括：向患者施用免疫毒素，所述免疫毒素包含与PE38截断的假单胞菌外毒素融合的单链可变区抗体，其中，所述单链可变区抗体具有如SEQIDNO：6-11所示的CDR1区、CDR2区和CDR3区；以及向所述患者施用免疫检查点抑制剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤是恶性神经胶质瘤。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤是乳腺癌。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤是头颈部鳞状细胞癌。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤是肺癌。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫毒素直接施用于所述肿瘤。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点选自由PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3和CSF-1R组成的组。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是抗PD-1抗体。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是抗CTLA4抗体。11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是抗LAG-3抗体。12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是抗TIM-3抗体。13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是抗CSF-1R抗体。14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检查点抑制剂是IDO的小分子抑制剂。15.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·比格纳，V·查德拉莫汉，S·奈尔，M·格罗迈耶，X·巴奥，I·H·帕斯坦，
申请(专利权)人：杜克大学，美国国立人类健康与服务卫生研究院，
类型：发明
国别省市：美国,US