具有高活性和降低脱靶的SIRNA结构制造技术

本发明专利技术提供用于使用RNA干扰来调节靶基因表达的化合物、组合物和方法。本发明专利技术的RNAi结构和分子可用于以高水平的RNAi活性和降低的脱靶作用来调节基因表达或使基因表达沉默。有利的结构包括靶向任意基因的、在种子区中含有一个或多个2’‑脱氧核苷酸的siRNA。所述RNA干扰分子可用于预防或治疗疾病的方法中。

SIRNA structure with high activity and lower miss distance

The present invention provides compounds, compositions and methods for regulating target gene expression using RNA interference. The RNAi structure and molecule of the present invention can be used to regulate gene expression or silence gene expression with high level of RNA activity and reduced off-target effect. Favorable structures include siRNA targeting any gene and containing one or more 2 '- deoxyribonucleotides in the seed region. The RNA interference molecule can be used in the prevention or treatment of diseases.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有高活性和降低脱靶的SIRNA结构
本专利技术涉及由基于核酸的分子构成的生物药物和治疗剂的领域。更具体而言，本专利技术涉及利用RNA干扰(RNAi)来调节基因表达的化合物结构及其用途。序列表本申请包括作为ASCII文件以电子形式提交的序列表，该文件创建于2016年1月2日，文件名为ND6122770WO_SL.txt，大小为170,872字节，其全部内容通过引用并入本说明书中。
技术介绍
RNA干扰(RNAi)已被用于通过短干扰RNA(siRNA)介导而在动物中进行的序列特异性转录后基因沉默。参见例如Zamore等人，Cell，2000，第101卷，第25-33页；Fire等人，Nature，1998，第391卷，第806811页；Sharp，Genes&Development，1999，第13卷，第139-141页。细胞中的RNAi应答可由双链RNA(dsRNA)引发，但机制尚未完全理解。一般而言，siRNA可为约21至约23个核苷酸长，并且，包含长度为约19个核苷酸的碱基对双链体(duplex)区。RNAi涉及被称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。siRNA具有反义链或引导链，该反义链或引导链进入RISC复合物，并介导对具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链靶RNA的切割。siRNA的另一条链是随从链(passengerstrand)。对靶RNA的切割在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中部发生。参见例如Elbashir等人，Genes&Development，2001，第15卷，第188-200页。为改善用作药剂的siRNA化合物的性质，已以各种方式对siRNA化合物的结构进行修饰，以求改善稳定性并降低脱靶(offtarget)效应。siRNA的脱靶活性与对除靶RNA外的细胞核酸的调节有关，其可能是通过多种机制发生的。对siRNA化合物的修饰包括改变任意的核苷酸的碱基、糖和/或主链的结构。修饰siRNA核苷酸的一种方式是使用脱氧核苷酸代替siRNA中的某些核糖核苷酸。具体而言，脱氧核苷酸通常被利用于siRNA结构的悬挂(overhang)或末端核苷酸中。然而，在siRNA结构中使用脱氧核苷酸的缺点在于，脱氧核苷酸不能用于siRNA的种子区中。这是因为，这种siRNA修饰会降低基因沉默活性，因此是不利的。人们迫切需要能够在不使活性损失的情况下降低脱靶作用的、用于调节基因表达的RNAi结构。特别地，基于对致癌基因(oncogenes)和癌症相关基因的RNAi抑制的治疗剂需要高效且稳定的siRNA序列和结构。需要具有高活性结构的siRNA化合物来调节基因表达。
技术实现思路
本专利技术涉及利用RNA干扰来调节靶基因表达的化合物、组合物和方法。本文公开的siRNA化合物和结构可高效地调节基因表达。本专利技术的RNAi结构可用于调节基因表达，其具有令人惊讶的高水平活性和降低的脱靶作用。在一些实施方式中，本专利技术提供通过RNA干扰实现基因沉默的分子，其降低脱靶作用且不损失活性。在其他一些实施方式中，本专利技术提供通过RNA干扰实现基因沉默的分子，其降低脱靶作用且具有出乎意料的高基因沉默活性。本专利技术的RNAi分子可提供高效且稳定的siRNA结构，其可用于基于对基因进行RNAi抑制的治疗剂。在其他一些实施方式中，本专利技术的结构、分子和组合物可用于预防或治疗与一种或多种基因相关的疾病、或者减轻与一种或多种基因相关的病症或紊乱的症状的方法。本专利技术包括以下实施方式：一种核酸分子，其中：a)该分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；b)该分子的每条链长度为15至30个核苷酸；c)该反义链中的15至30个核苷酸的连续区域与mRNA的序列互补；d)该有义链的至少一部分与该反义链的至少一部分互补，且该分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区，其中，双链体区中反义链的自5’端起第3至8位的核苷酸中的一个或多个是脱氧核苷酸。该mRNA可为人类mRNA。在一些实施方式中，该核酸分子反义链可在多个位置具有脱氧核苷酸，该多个位置为以下中的一者：反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。该核酸分子可为具有调节mRNA表达的活性的RNAi分子。在某些实施方式中，该核酸分子可具有抑制选自蛋白质编码基因、原癌基因(proto-oncogenes)、致癌基因、肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgenes)和细胞信号传导基因(cellsignalinggenes)中的基因的表达的活性。在其他一些实施方式中，该mRNA可以是表达下述人类蛋白质家族的任意成员或亚成员(sub-member)的人类mRNA，所述人类蛋白质家族包括：SRY、β-球蛋白、RAS、胞质GST、线粒体GST、MAPEGGST、GST-π、p16、p21、p53、血清白蛋白、VII型胶原、补体C3、载脂蛋白B、苯丙氨酸羟化酶、VIII因子、亨廷顿蛋白(Huntingtin)、RB1视网膜母细胞瘤蛋白、CFTR、肌联蛋白(Titin)、肌营养相关蛋白(Utrophin)和抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)。该核酸分子敲低(knockdown)该mRNA的IC50可以小于100pM、或小于50pM、或小于10pM。在某些实施方式中，单次给予该分子后，该核酸分子可在体内将该mRNA抑制至少25％。在一些实施方式中，该分子的每条链的长度为18至22个核苷酸。该双链体区的长度可为19个核苷酸。在某些实施方式中，该多核苷酸有义链和该多核苷酸反义链可以单链形式连接，且形成在一端以环(loop)连接的双链体区。该核酸分子可具有平末端(bluntend)。在某些实施方式中，该核酸分子可具有一个或多个3’悬挂。本专利技术的实施方式包含在双链体区中具有一个或多个经修饰或经化学修饰的核苷酸的核酸分子。该经修饰或经化学修饰的核苷酸可以是2’-O-烷基取代核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸、锁核苷酸(lockednucleotides)或它们的任意组合。本专利技术还涵盖含有该核酸分子和药学上允许的担体(carrier)的药物组合物。该担体可为脂质分子或脂质体。本专利技术的实施方式还包括含有该核酸分子的载体或细胞。本专利技术还涵盖通过基因沉默来预防、治疗或减轻有需要的受试者的疾病的方法，所述方法通过向受试者给予含有该核酸分子的组合物来进行。该疾病可为恶性肿瘤、癌症、肉瘤或癌瘤(carcinoma)。本专利技术的实施方式包括核酸分子组合物用于预防、减轻或治疗有需要的受试者的疾病或病症的用途。在某些实施方式中，本专利技术的组合物可用于医学疗法中。在其他实施方式中，本专利技术的组合物可用于对人体或动物体的治疗中。在其他实施方式中，本专利技术的组合物可用于制备或制造用于预防、减轻或治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物。附图说明图1：图1显示靶向GST-π的本专利技术的siRNA使体内原位肺癌肿瘤显著缩小。将GST-πsiRNA以脂质体制剂形式、以2mg/kg的剂量给予患有A549原位肺癌肿瘤的无胸腺裸小鼠。在对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸分子，其中：a)所述分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；b)所述分子的每条链的长度为15至30个核苷酸；c)所述反义链中的15至30个核苷酸的连续区域与mRNA的序列互补；d)所述有义链的至少一部分与所述反义链的至少一部分互补，且所述分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区，其中，所述双链体区中所述反义链的自5’端起第3至8位中的一个或多个核苷酸是脱氧核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.13 US 62/266,6751.一种核酸分子，其中：a)所述分子具有多核苷酸有义链和多核苷酸反义链；b)所述分子的每条链的长度为15至30个核苷酸；c)所述反义链中的15至30个核苷酸的连续区域与mRNA的序列互补；d)所述有义链的至少一部分与所述反义链的至少一部分互补，且所述分子具有长度为15至30个核苷酸的双链体区，其中，所述双链体区中所述反义链的自5’端起第3至8位中的一个或多个核苷酸是脱氧核苷酸。2.权利要求1的分子，其中，所述反义链在多个位置具有脱氧核苷酸，所述多个位置为以下中的一者：反义链的自5’端起第4、6和8位中的每一处；反义链的自5’端起第3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第1、3、5和7位中的每一处；反义链的自5’端起第3-8位中的每一处；和反义链的自5’端起第5-8位中的每一处。3.权利要求1的分子，其中，所述分子是具有调节mRNA表达的活性的RNAi分子。4.权利要求1的分子，其中，所述分子具有抑制选自蛋白质编码基因、原癌基因、致癌基因、肿瘤抑制基因和细胞信号传导基因中的基因的表达的活性。5.权利要求1的分子，其中，所述mRNA是人类mRNA。6.权利要求1的分子，其中，所述mRNA是表达下述人类蛋白质家族的任意成员或亚成员的人类mRNA，所述人类蛋白质家族包括：SRY、β-球蛋白、RAS、胞质GST、线粒体GST、MAPEGGST、GST-π、p16、p21、p53、血清白蛋白、VII型胶原、补体C3、载脂蛋白B、苯丙氨酸羟化酶、VIII因子、亨廷顿蛋白、RB1视网膜母细胞瘤蛋白、CFTR、肌联蛋白、肌营养相关蛋白和抗肌萎缩蛋白。7.权利要求1的分子，其中，所述分子对所述mRNA进行敲低的IC50小于100pM。8.权利要求1的分子，其中，所述分子对所述mRNA进行敲低的IC50小于50pM。9.权利要求1的分子，其中，所述分子对所述mRNA进行敲低的IC50小于10pM。10.权利要求1的分子，其中，单次给予所述分子在体内将所述mRNA抑制至少25％。11.权利要求1的分子，其中，所述分...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹温平，味吞宪二郎，詹斯·贺柏士，希玛·希纳，郑雪英，纳瑞达·瓦许，
申请(专利权)人：日东电工株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP