含有DHAV-1 2A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法技术

本发明专利技术提供了一种含有DHAV‑1 2A1‑P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV‑1 2A1‑P氨基酸序列，该多肽的氨基酸序列从C端起计数，氨基酸数量大于10。多蛋白共表达方法，包括以下步骤：合成编码上述多肽的基因片段以及所要共表达的基因片段，将这些基因片段通过重叠PCR技术进行重叠，得到基因大片段，再将该基因大片段和载体质粒通过酶切、连接，得重组质粒，将重组质粒转化感受态细胞进行表达，获得独立的多种蛋白。此方法不需要插入额外的蛋白酶位点，在翻译过程中自动进行断裂，翻译完成后形成独立的蛋白，同时不会影响所需蛋白的功能。

Polypeptide containing DHAV-1 2A1-P and its multi protein co expression method

The invention provides a polypeptide containing DHAV 1 2A1 P and its mediated polyprotein co expression method. The amino acid sequence of the polypeptide contains the DHAV sequence of the GxExNPGP sequence of the C terminal, the amino acid sequence of the P, the amino acid sequence of the polypeptide is counted from the C end, and the number of amino acids is greater than 10. The method of multi protein co expression includes the following steps: the gene fragment encoding the above polypeptide and the gene fragment to be co expressed by overlapping the gene fragment by overlapping PCR technology to get the large fragment of the gene, and then the recombinant plasmid is reorganized by cutting the large fragment of the gene and the vector plasmid through the enzyme to get the recombinant plasmid. The plasmids were transformed into competent cells to express independent proteins. This method does not need to insert extra protease loci, break automatically during translation, and form independent protein after translation, and it does not affect the function of the required protein.

【技术实现步骤摘要】
含有DHAV-12A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种含有DHAV-12A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法。
技术介绍
鸭病毒性肝炎(DuckViralHepatitis,DVH)是由小RNA病毒科中的鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirusI，DHAV-1)引起的雏鸭的一种急性，出血性，高度致死性疾病。鸭病毒性肝炎主要以雏鸭发生肝炎，肝脏肿大及出血，质度脆，脾脏肿胀坏死和肾肿胀为病理特征，具有高度传染性和接触性，发病迅速，死亡率高，日龄越小，发病率和死亡率越高，呈世界性分布。临床表现为发病初期病鸭精神萎靡，食欲减退，废绝，眼半闭呈昏睡状，以头触地，半天至一天后出现神经症状，运动失调，身体倒向一侧，两脚痉挛，死鸭呈现角弓反张状，两脚伸直向后张开呈特殊姿势。最急性病毒，可不见任何异常而突然抽搐痉挛死亡。该病一年四季均可爆发，对养殖业造成了巨大的经济损失。鸭甲肝病毒属于单股正链RNA病毒，其基因组结构由5’非编码区(5’untranslationregion，5’UTR)、一个大的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)、3’非编码区(3’UTR)和poly(A)尾组成，当ORF在宿主细胞中表达出多聚蛋白后，被病毒自身编码的蛋白酶切割为成熟蛋白。多聚蛋白首先分解成P1、P2和P3产物，其次，P1、P2和P3又进一步分别分解为VP0、VP1和VP3，2A1、2A2、2A3、2B、2C和3A、3B、3C和3D蛋白。P1编码结构蛋白(VP0、VP1和VP3)，P2和P3区编码非结构蛋白(2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C和3D)，因此，DHAV-1基因组结构为：5’UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR-poly(A)。传统的用于多蛋白共表达策略主要有：(1)多启动表达载体：在同一个载体中插入多个独立的转录单元，每个转录单元有自己的启动子和ORF，其缺点是基因表达水平不平衡，在某些细胞系中，启动子之间产生干扰，甚至发生基因重排，而且转录单元数有限制。(2)剪切载体：利用同一个启动子，形成一个完整的转录本；初级转录本在剪切信号处断裂形成独立的次级mRNA，分别翻译成不同的蛋白。缺点是剪切信号机制不清楚，很难控制。(3)融合蛋白：将多个蛋白顺序连接，在同一个启动子的转录下，形成一个完整的转录本，翻译成一个融合蛋白。因为产物是融合蛋白，蛋白不会分离，可能会影响某个蛋白的功能，且达不到获得某种蛋白的目的。(4)插入蛋白酶切位点：Furin是真核细胞中高度保守的一种蛋白酶，定位在高尔基体上，能特异性识别Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg位点。利用这个特性，可以在蛋白连接处加入这个蛋白酶识别位点，这样融合蛋白翻译后在高尔基体处被Furin所切割。由于Furin定位在高尔基体上，内质网和高尔基体加工的蛋白通常是分泌蛋白和膜结合蛋白，生物体中还有相当数量的蛋白存在细胞质中的，并不都需要内质网和高尔基体加工，这极大的限制了该方法的应用。(5)加入内部核糖体进入位点IRES：IRES能独立地起始翻译。IRES可以用于连接多个ORF，每个ORF翻译是独立的，其优点在于翻译后的蛋白是分开的。但是其缺点是序列较长结构较大，一般有几百个碱基，容易影响表达蛋白的结构和功能。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种含有DHAV-12A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV-12A1-P氨基酸序列，多蛋白共表达方法是在编码2A1-P氨基酸的基因片段上连接2个或2个以上的基因片段，然后进行表达，表达后的蛋白各自独立，且不会影响表达蛋白的功能。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种含有DHAV-12A1-P的多肽，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV-12A1-P氨基酸序列，该多肽的氨基酸序列从C端起计数，氨基酸数量大于10。进一步地，该多肽的氨基酸序列还包括向DHAV-12A1的上游VP1延伸的氨基酸序列。一种多蛋白共表达方法，包括以下步骤：(1)合成编码上述含有DHAV-12A1-P的多肽的基因片段并进行PCR扩增；(2)合成编码所要共表达的基因片段并进行PCR扩增；(3)将步骤(1)所得基因片段与步骤(2)所得基因片段通过重叠PCR技术进行基因片段的重叠，得到所要表达的基因大片段；(4)将步骤(3)所得基因大片段和载体质粒通过酶切、连接，得重组质粒；(5)将重组质粒转化感受态细胞进行表达，获得独立的多种蛋白。进一步地，步骤(2)中所要共表达的基因片段为2个或2个以上。进一步地，步骤(1)和步骤(2)中PCR扩增体系为：DMA2μL，高保真酶25μL，20mmol/L的上游和下游引物各2μL，然后用ddH2O补足至50μL。进一步地，步骤(1)和步骤(2)中PCR扩增程序为：98℃预变性2min，98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。进一步地，步骤(3)中重叠PCR第一轮体系为：报告基因2pmol，所要连接的基因片段1pmol，高保真酶10μL，然后用ddH2O补足至20μL；重叠PCR第一轮反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火5s、72℃延伸2min，共6个循环；重叠PCR第二轮体系：在第一轮体系基础上加入最上游引物和最下游引物各0.5μl；反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火5s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。进一步地，步骤(4)中酶切体系：BamHI1.0μL，XhoⅠ1.0μL，10×QuickBuffer5.0μL，质粒/基因大片段1.0μg，然后用ddH2O补足至50μL。本专利技术提供的一种含有DHAV-12A1-P的多肽及其介导的多蛋白共表达方法，具有以下有益效果：DHAV-1中2A1与2A2之间肽键的断裂是基于核糖体跳跃机制，在病毒翻译完2A1后，2A1和2A2之间不形成肽键，核糖体在没有肽键的情况下继续翻译后面的2A2氨基酸，从而形成分开的2A1和2A2蛋白。因此，将所要表达的基因片段与含有DHAV-12A1-P的片段利用重叠PCR技术进行片段的重叠，便可得到所要表达的基因大片段，将该基因大片段再连接到表达载体上，最后转染到细胞内进行表达，便可得到所要的表达蛋白。此方法不需要插入额外的蛋白酶位点，也就不需要额外的蛋白酶进行加工，此方法是在翻译过程中自动进行断裂，翻译完成后形成独立的蛋白。因2A1-P序列很短，翻译后的蛋白质量小，因此，不会影响所需蛋白的功能；同时，可以在2A1-P两边连接多个所要表达的基因片段，表达后的每种蛋白都是分离且独立的，可以将其应用于多介菌苗生产时，不会对免疫效果造成影响，对细胞和物种也没有特异性。附图说明图1为用含有2A1-P的序列的6种DHAV-1基因片段连接EGFP和RFP报告基因的展示图。图2为7种载体种的EGFP基因扩增图。图3为含有2A1-P的6种基因序列的扩增图。图4为7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有DHAV‑1 2A1‑P的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV‑1 2A1‑P氨基酸序列，该多肽的氨基酸序列从C端起计数，氨基酸数量大于10。

【技术特征摘要】
1.一种含有DHAV-12A1-P的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列包括C端含GxExNPGP序列的DHAV-12A1-P氨基酸序列，该多肽的氨基酸序列从C端起计数，氨基酸数量大于10。2.根据权利要求1所述的含有DHAV-12A1-P的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列还包括向DHAV-12A1的上游VP1延伸的氨基酸序列。3.一种多蛋白共表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成编码权利要求1或2所述多肽的基因片段并进行PCR扩增；(2)合成编码所要共表达的基因片段并进行PCR扩增；(3)将步骤(1)所得基因片段与步骤(2)所得基因片段通过重叠PCR技术进行基因片段的重叠，得到所要表达的基因大片段；(4)将步骤(3)所得基因大片段和载体质粒通过酶切、连接，得重组质粒；(5)将重组质粒转化感受态细胞进行表达，获得独立的多种蛋白。4.根据权利要求3所述的多蛋白共表达方法，其特征在于，步骤(2)中所要共表达的基因片段为2个或2个以上。5.根据权利要求3所述的多蛋白共表达方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中PCR扩增体系为：DMA2μL，高保真酶25μL，20mmol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，杨晓尧，汪铭书，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51