一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用。利用本发明专利技术的引物对样品进行检测，可实现一次性同时特异性检测样本中的无乳链球菌和海豚链球菌。本发明专利技术建立的分子检测方法对无乳链球菌和海豚链球菌的检测下限均为1.5pg/μL和5.8CFU/μL；在人工分别感染无乳链球菌和海豚链球菌的混合罗非鱼组织样中，其对两种菌的灵敏度均为105CFU/g；在腹腔注射无乳链球菌和海豚链球菌的罗非鱼脑、肝脏、脾脏和肾脏等组织器官中都能检出。本方法可同时快速检测罗非鱼养殖中无乳链球菌和海豚链球菌，对检测对象损伤小、快速准确、操作简便，可实现罗非鱼链球菌病的早期分子预警。

A pair of primers for simultaneous detection of Streptococcus and Streptococcus suis and its application

The invention discloses a pair of primers for simultaneous detection of Streptococcus and Streptococcus, and its application. The primers of the invention can be used to detect the samples at the same time to achieve a one-time and specific detection of Streptococcus agalactis and Streptococcus dolphinis in the samples. The detection limits of the molecular detection methods for Streptococcus lactis and Streptococcus lactis were 1.5pg/ and 5.8CFU/ mu L, and the sensitivity of the two strains of Streptococcus and Streptococcus in artificial Streptococcus, respectively, was 105CFU/g, and Streptococcus and Streptococcus in the ventral cavity were injected into the abdominal cavity. Tilapia can be detected in brain, liver, spleen and kidney. This method can be used to detect Streptococcus nilacae and Streptococcus in the culture of tilapia at the same time. It has small damage, fast accuracy and easy operation. It can realize early molecular early warning of Streptococcus mutans disease.

【技术实现步骤摘要】
一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
本专利技术涉及靶DNA片段的检测技术，具体涉及一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用。
技术介绍
罗非鱼是世界上养殖最广泛的鱼类之一，全球产量仅在2013年就达到450万吨。尽管罗非鱼在差水质中耐受力比其他淡水鱼更好，但随着水产养殖活动的广泛开展，养殖业受到了各种各样的病原体的影响，最为突出的就是链球菌。链球菌病的病原菌主要是无乳链球菌和海豚链球菌，具有发病率高和死亡率高的特点，目前已经造成巨大经济损失。无乳链球菌和海豚链球菌很难被区别鉴定，特别是又具有高同源性，所以容易造成误诊，更是难以区分。自从1957年在日本培养的虹鳟鱼首次被报道感染了链球菌以来，由于无乳链球菌和海豚链球菌具有类似的临床症状，因此还未能建立一种简单、便捷和高效的分子诊断技术。传统的生理生化测试方法，都比较耗时和费力；另外，由于链球菌病发病迅速，如诊断不及时、不准确，也会影响后续的预防和治疗。此外，相似的表型和生物化学特征也会导致错误的鉴定。目前，已经有一些新技术被应用于罗非鱼链球菌的诊断，如16S测序技术、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、循环介导等温扩增技术、双重、多重和定量PCR等。但这些技术也存在一定的不足，如16S测序技术很难区分同源性较高的种类；荧光抗体技术和ELISA存在成本昂贵及操作步骤繁杂等；LAMP易发生假阳性；定量PCR需要昂贵的仪器、专业的操作并且成本较高；双重和多重PCR的两对及以上的引物间会产生干扰等。因此，需要建立一种方便、灵敏、快速和经济的诊断罗非鱼链球菌病的方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物。本专利技术的另一目的在于提供一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供上述引物或试剂盒的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法。该方法对检测对象损伤小、快速准确、操作简便。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，包括如下引物序列：ST-1：5'-TGAGGTAACCTTTTAGGAGC-3'；ST-2：5'-AATCGCTTTTGCTTTCTC-3'。本专利技术提供一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒，包括上述引物ST-1和ST-2。本专利技术提供上述引物或试剂盒在鉴定无乳链球菌和海豚链球菌中的应用。本专利技术还提供一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法，包括如下步骤：(1)取待检样品；(2)加入含有上述引物ST-1和ST-2的反应混合液和待检样品，配成PCR反应体系混合液；进行PCR反应于一个反应程序：95℃预变性5min，94℃30sec，60℃30sec和72℃1min的30个循环，最后72℃延伸10min；(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测检测液是否出现特异的DNA条带，出现则判定为阳性；没有出现特异性条带的则判定为阴性；阳性表示待检样品中含有无乳链球菌或/和海豚链球菌；阴性表示不含有无乳链球菌和海豚链球菌；其中，出现616bp片段的为无乳链球菌，794bp片段的则为海豚链球菌。所述的PCR反应体系混合液是1μL的待检样品、0.2μM的引物ST-1、0.2μM的引物ST-2、不含MgCl2的1×Taqbuffer、0.2mM的dNTP、0.625U的Taq酶、2mM的MgCl2和DEPC水，总体积为25μL。所述的待检样品包括但不限于无乳链球菌和海豚链球菌的基因组DNA、菌落和组织样品；优选为鱼的脑、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉或细菌。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术解决了现有技术检测无乳链球菌和海豚链球菌存在的周期长、操作复杂、检测成本高等问题，本专利技术最短在1.5h内即可完成所有检测操作，简单快速；(2)本专利技术基于检测16S-23S的基因序列，可同时快速地检测养殖生产中的无乳链球菌和海豚链球菌，准确性高，其对基因组DNA和菌落检测下限分别为1.5pg/μL(DNA)和5.8CFU/μL(单菌落)；(3)无乳链球菌和海豚链球菌的人工感染最低检出下限均为105CFU/g；(4)检测成本低，只需一对引物，操作简便，适合多样本的同时检测；(5)本专利技术还可以用于鱼的脑、脾脏、肝脏、肾脏、肌肉和水体中无乳链球菌和海豚链球菌的检测及鉴定。(6)本专利技术所用的一对特异性引物ST-1和ST-2，是根据无乳链球菌和海豚链球菌的全基因序列，尤其是16S和23S设计的。按照本专利技术的方法对样品进行分子检测，可实现一次性同时特异性检测样本中的无乳链球菌和海豚链球菌。本专利技术建立的分子检测方法对无乳链球菌和海豚链球菌的检测下限均为1.5pg/μL(DNA)和5.8CFU/μL(单菌落)；在人工分别感染无乳链球菌和海豚链球菌的混合罗非鱼组织样中，其对两种菌的灵敏度均为105CFU/g；在腹腔注射无乳链球菌(1.83×107CFU/mL)和海豚链球菌(4×107CFU/mL)的罗非鱼脑、肝脏、脾脏和肾脏等组织器官中都可以检测出无乳链球菌和海豚链球菌。本方法可同时快速检测罗非鱼养殖中无乳链球菌和海豚链球菌，可实现罗非鱼链球菌病的早期分子预警。附图说明图1是通用引物扩增16SrDNAPCR产物的琼脂糖凝胶电泳(a)和引物ST-1和ST-2扩增特异性序列(b)；其中，M代表DNA2000bp大小标记；泳道1和泳道2分别代表了无乳链球菌ATCC13813和海豚链球菌ATCC29178参考菌株，泳道B同时含有这两个细菌；泳道3-9代表停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和大肠杆菌。图2是特异引物对无乳链球菌的敏感性；其中，(a)M代表DNA2000bp大小marker，P为阳性对照，N为阴性对照；泳道1-8分别代表无乳链球菌DNA的150ng/μL、15ng/μL、1.5ng/μL、0.15ng/μL、15pg/μL、1.5pg/μL、0.15pg/μL和15fg/μL；(b)M代表DNA2000bp大小marker，P为阳性对照，N为阴性对照；泳道1-8代表用于扩增的细菌数量：5.8×105、5.8×104、5.8×103、5.8×102、5.8×101、5.8×100、5.8×10-1和5.8×10-2CFU/mL。图3是特异引物对海豚链球菌的敏感性；其中，(a)M代表DNA2000bp大小marker，P为阳性对照，N为阴性对照；泳道1-8分别代表无乳链球菌DNA的15ng/μL、1.5ng/μL、0.15ng/μL、15pg/μL、1.5pg/μL、0.15pg/μL、15fg/μL和1.5fg/μL；(b)M代表DNA2000bp大小marker，P为阳性对照，N为阴性对照；泳道1-8代表用于扩增的细菌数量：5.8×104、5.8×103、5.8×102、5.8×101、5.8×100、5.8×10-1、5.8×10-2和5.8×10-3CFU/mL。图4是特异引物应用于人工标本的检测灵敏度；(a)无乳链球菌，(b)海豚链球菌；其中，M代表DNA2000bp大小标记，P为阳性对照，N为阴性对照；通过一个引物，预计616bp和794本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，其特征在于包括如下引物序列：ST‑1：5'‑TGAGGTAACCTTTTAGGAGC‑3'；ST‑2：5'‑AATCGCTTTTGCTTTCTC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一对同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，其特征在于包括如下引物序列：ST-1：5'-TGAGGTAACCTTTTAGGAGC-3'；ST-2：5'-AATCGCTTTTGCTTTCTC-3'。2.权利要求1所述的同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物在鉴定无乳链球菌和海豚链球菌中的应用。3.一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物ST-1和ST-2。4.权利要求2所述的同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒在鉴定无乳链球菌和海豚链球菌中的应用。5.一种同时快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取待检样品；(2)加入含有权利要求1所述的引物ST-1和ST-2的反应混合液和待检样品，配成PCR反应体系混合液；进行PCR反应于一个反应程序：95℃预变性5min，94℃30sec，60℃30sec和72℃1min的30个循环，最后72℃延伸10min；(3)采用琼...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔淼，张辉杰，张其中，许德麟，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44