L-甲硫氨酸的制备方法技术

本发明专利技术涉及使用生物合成工艺和特定的酶促工艺制造L‑甲硫氨酸的方法。更特别地，本发明专利技术涉及在甲硫醇(CH3SH)的存在下由L‑甲硫氨酸前体通过酶转化反应以高产率制造L‑甲硫氨酸的方法。本发明专利技术的方法使得能够选择性制造L‑甲硫氨酸，其可用在各种工业领域中，例如饲料和食品添加剂、用于医疗用品、药物的原料等。

Preparation of L- methionine

The invention relates to a method for the production of L methionine by using biosynthesis technology and specific enzymatic process. More particularly, the invention relates to a method of producing L methionine at high yield in the presence of methionine (CH3SH) in the presence of L methionine precursor through an enzyme conversion reaction. The method of the invention makes it possible to selectively manufacture L methionine, which can be used in various industrial fields, such as feed and food additives, for medical supplies, materials for drugs and so on.

【技术实现步骤摘要】
L-甲硫氨酸的制备方法本申请是基于申请日为2011年09月02日、申请号为201180073229.2、专利技术名称为“L-甲硫氨酸的制备方法”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及使用生物合成工艺和特定的酶促工艺制造L-甲硫氨酸的方法。更特别地，本专利技术涉及在甲硫醇(CH3SH)的存在下由L-甲硫氨酸前体通过酶转化反应以高产率制造L-甲硫氨酸的方法。本专利技术的制造L-甲硫氨酸的方法是比现有技术已知的常规方法更环境友好的，且使得能够选择性制造L-甲硫氨酸，其可用在各种工业领域中，例如饲料和食品添加剂、用于医疗用品、药物的原料等。
技术介绍
甲硫氨酸是人体的必须氨基酸之一，且已经广泛地用作饲料和食品添加剂并进一步用作用于医用溶液、医疗用品以及药物的合成原料。甲硫氨酸作为如胆碱(卵磷脂)和肌酸这样的化合物的前体且同时用作用于半胱氨酸和牛磺酸的合成原料。甲硫氨酸还可提供硫。S-腺苷-L-甲硫氨酸源自甲硫氨酸，并在人体中提供甲基方面发挥一定的作用，而且还涉及在脑中各种神经递质的合成。L-甲硫氨酸(L-Met)和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)抑制在肝脏和动脉中的脂肪积累，促进脂质代谢。其还改善在脑、心脏和肾脏中的血液循环，和因此用作用于减轻炎症、肌肉疼痛和肝脏疾病的抗抑制剂(anti-depressionagent)，尤其在由酒精造成的肝脏疾病中是有效的。其还可用于促进有毒物质的消化、解毒和排泄以及重金属如铅的排泄。其具有对于骨和关节疾病的抗炎作用并促进关节恢复，且还作为头发的必须营养素，由此防止掉发。已知甲硫氨酸根据化学和/或生物合成制备，这已经是许多工作和研究的主题，主要目标在于提出更有效、更选择性和更环境友好的制备方法。在化学合成中，甲硫氨酸主要通过5-(β-甲基巯基乙基)乙内酰脲的水解制造。化学合成的甲硫氨酸具有仅以L-型和D-型的混合形式制造的缺点。在生物合成中，甲硫氨酸通过使用在甲硫氨酸合成中涉及的蛋白质的方法制造。L-甲硫氨酸通过由多种基因如metA、metB、metC、metE和metH表达的酶的作用从高丝氨酸生物合成。特别地，metA是编码作为甲硫氨酸生物合成必须的第一酶的高丝氨酸-O-琥珀酰基转移酶的基因，且其将高丝氨酸转化成O-琥珀酰基-L-高丝氨酸。通过metB基因编码的O-琥珀酰基高丝氨酸裂合酶或胱硫醚-γ-合酶将O-琥珀酰基-L-高丝氨酸转化成胱硫醚。通过metC基因编码的胱硫醚-β-裂合酶将胱硫醚转化成L-高半胱氨酸。MetE编码钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶且metH编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶，这两者将L-高半胱氨酸转化成L-甲硫氨酸。此时，由metF编码的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶和由glyA编码的丝氨酸羟甲基转移酶一起工作以合成N(5)-甲基四氢叶酸，其提供L-甲硫氨酸合成必需的甲基。L-甲硫氨酸通过由上述酶的一系列有机反应合成。通过常规生物方法制造的甲硫氨酸是L-型的，其具有优点但是产量太小。这是因为甲硫氨酸的生物合成路线具有非常紧凑的(tight)反馈调节系统。一旦甲硫氨酸合成到一定水平，最终产物甲硫氨酸抑制metA基因的转录，所述metA基因编码用于引发甲硫氨酸生物合成的第一蛋白质。metA基因本身的过表达不能增加甲硫氨酸的产量，因为metA基因在转录阶段被甲硫氨酸抑制且在翻译阶段被细胞内蛋白酶降解。常规的甲硫氨酸生物合成方法使用胱硫醚合酶代谢路径以制造甲硫氨酸，因此由于硫化物毒性和副产物的产生，酶反应过程是效率低的。另外，甲硫氨酸合成路径中的反馈调节抑制甲硫氨酸的大量生产。克服上述问题的制造L-甲硫氨酸的替代方法公开在以序号WO2008/013432公开的国际申请中。该替代方法由两步法构成，其中通过发酵制造L-甲硫氨酸前体和将L-甲硫氨酸前体通过酶选择性地转化为L-甲硫氨酸。更准确地，WO2008/013432公开了包括如下步骤的制造L-甲硫氨酸的方法：1)制备产生L-甲硫氨酸前体的菌株并通过所述菌株的发酵制造L-甲硫氨酸前体；和2)使用所述L-甲硫氨酸前体通过酶反应产生L-甲硫氨酸和有机酸。步骤2)过程包括通过使用由以上产生L-甲硫氨酸前体的菌株产生的O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸以及甲硫醇作为底物使用具有胱硫醚合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶或包含这些酶活性的菌株通过酶反应产生L-甲硫氨酸和有机酸的过程。WO2008/013432提供对步骤2)的大体信息，其在于在甲硫醇的存在下通过酶反应将L-甲硫氨酸前体转化为L-甲硫氨酸。即使L-甲硫氨酸的总产率是满意的，但是仍然存在对如下的需要：甚至更加改善L-甲硫氨酸的生物合成，尤其是改善L-甲硫氨酸前体与甲硫醇的酶促转化步骤以特别地以改善的产率获得L-甲硫氨酸。
技术实现思路
因此，本专利技术的第一目标是提供L-甲硫氨酸前体与甲硫醇的酶促转化以改善的产率获得L-甲硫氨酸的改善的方法。更特别地，本专利技术提供通过L-甲硫氨酸前体和甲硫醇的酶反应产生L-甲硫氨酸的方法。在本专利技术的方法中，L-甲硫氨酸前体可为现有技术中已知的任意前体，其能够通过与甲硫醇的酶反应转化为L-甲硫氨酸，且例如WO2008/013432中公开的。根据本专利技术的优选方面，通过使用作为底物积累的高丝氨酸、O-磷酰基-高丝氨酸、O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸，用于转化L-甲硫氨酸的酶优选选自胱硫醚合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。更优选地，用在本专利技术的方法中的L-甲硫氨酸前体选自O-琥珀酰基高丝氨酸(OSH)和O-乙酰基高丝氨酸(OAH)。还更优选地，L-甲硫氨酸前体是OAH。在本专利技术的方法中，当将O-乙酰基高丝氨酸用作L-甲硫氨酸前体时，优选地，可使用优选源自钩端螺旋体属菌种(Leptospirasp.)、色杆菌属菌种(Chromobacteriumsp.)、或生丝单胞菌属菌种(Hyphomonassp.)的胱硫醚-γ-合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(OAHS)，更优选源自迈氏钩端螺旋体(Leptospirameyeri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaurogenosa)、海王生丝单胞菌(HyphomonasNeptunium)或紫色色杆菌(ChromobacteriumViolaceum)的胱硫醚-γ-合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(OAHS)。本专利技术的酶反应过程可以如下流程表示：O-琥珀酰基-L-高丝氨酸+CH3SH←→L-甲硫氨酸+琥珀酸根O-乙酰基-L-高丝氨酸+CH3SH←→L-甲硫氨酸+乙酸根其中该反应是酶促反应且以甲硫醇(CH3SH)的特定压力范围操作。在上述反应中，甲硫醇的CH3S-残基被O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的琥珀酸根或乙酸根残基取代以产生L-甲硫氨酸。根据本专利技术，将甲硫醇在精确的压力范围下加入，如本说明书中进一步解释的。在甲硫醇的存在下将L-甲硫氨酸前体转化为L-甲硫氨酸的上述反应是酶促反应，例如WO2008/013432中公开的。WO2008/013432提供了对可使用的酶的性质和制备的细节，所述酶是具有在甲硫醇的存在下将L-甲硫氨酸前体转化为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.L‑甲硫氨酸前体与甲硫醇的酶促转化以获得L‑甲硫氨酸的方法，其中在反应容器中在反应介质上方的甲硫醇分压范围为10kPA‑180kPA、优选51kPa‑180kPa、更优选51kPa‑160kPa、还更优选约80kPa‑约160kPa、有利地约90kPa‑约150kPa，例如CH3SH分压为约100kPa‑150kPa，在反应温度下。

【技术特征摘要】
1.L-甲硫氨酸前体与甲硫醇的酶促转化以获得L-甲硫氨酸的方法，其中在反应容器中在反应介质上方的甲硫醇分压范围为10kPA-180kPA、优选51kPa-180kPa、更优选51kPa-160kPa、还更优选约80kPa-约160kPa、有利地约90kPa-约150kPa，例如CH3SH分压为约100kPa-150kPa，在反应温度下。2.权利要求1的方法，其中所述反应温度范围为20℃-45℃、优选25℃-40℃、还更优选30℃-40℃。3.前述权利要求任一项的方法，其中所述L-甲硫氨酸前体为O-琥珀酰基高丝氨酸(OSHS)和O-乙酰基高丝氨酸(OAHS)，且优选为OAHS。4.前述权利要求任一项的方法，其中用于所述酶促转化的酶使用根据生物技术工艺的基因表达制备。5.前述权利要求任一项的方法，其中用于所述酶促转化的酶选自源自假单胞菌属菌种(Pseudomonassp.)、色杆菌属菌种(Chromobacteriumsp.)、钩端螺旋体属菌种(Leptospirasp.)、或生丝单胞菌属菌种(Hyphomonassp.)的胱硫醚-γ-合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。6.前述权利要求任一项的方法，其中反应的pH维持在约中性或稍微酸性的值，优选反应介质的pH维持在6-7。7.前述权利要求任一项的方法，其中加入辅酶，所述辅酶优...

【专利技术属性】
技术研发人员：G弗雷米，P巴里，金素影，孙晟光，李相穆，
申请(专利权)人：阿克马法国公司，CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：法国,FR