检测SA肠毒素SEI的试剂及制备方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了快速检测SA(金黄色葡萄球菌)肠毒素SEI的试剂及制备方法和所构成的试剂盒，通过基因工程技术制备了SA重组肠毒素SEI，并与抗SA肠毒素SEI单克隆抗体和羊抗鼠IgG配合组装成ICCGIC试纸条，实现针对液体奶中SA肠毒素SEI的快速、简便、准确的检测。

Reagent for detecting SA enterotoxin SEI, preparation method and kit

The invention discloses a reagent and a preparation method and a kit for rapid detection of SA (Staphylococcus aureus) enterotoxin SEI. The recombinant enterotoxin SEI of SA is prepared by genetic engineering technology, and a ICCGIC trial strip is assembled with the anti SA enterotoxin SEI monoclonal antibody and Sheep anti mouse IgG, and the SA enterotoxin SEI is realized in liquid milk. Rapid, simple and accurate detection.

【技术实现步骤摘要】
检测SA肠毒素SEI的试剂及制备方法和试剂盒
本专利技术涉及一种检测SA(金黄色葡萄球菌)肠毒素SEI的试剂及制备方法和所构成的试剂盒，特别是一种快速检测SA肠毒素SEI的试剂及制备方法和所构成的试剂盒，属生物

技术介绍
SA(金黄色葡萄球菌，Staphylococcusaureus，)是一种引起奶牛乳房炎(Bovinemastitis)最常见的病原微生物。近年来，随着我国奶牛养殖业的快速发展，奶牛乳房炎已经成为对奶牛场危害最大、投入药费最多、防治最难的疾病之一，它不仅严重影响奶牛的产乳量，而且患病牛产生的牛奶中含有大量的SA及其分泌肠毒素，可引起食物中毒，直接危害人类健康。肠毒素(Enterotoxins，SEs)是SA在生长繁殖过程中产生的一类能够引起急性胃肠炎的外毒素，在低浓度就能够产生致毒活性。SA肠毒素对热稳定，易溶于水和盐溶液。虽然在高温(100℃、30min)或低pH值环境条件下SA很容易就被杀灭，但是由SA产生的肠毒素仍然具有活性，并且肠毒素能够抵抗胃肠液中蛋白酶的水解作用，因此当人食入后污染SA的食物后引起中毒。目前，已经发现的SA肠毒素包括传统肠毒素[S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测SA肠毒素SEI的试剂的制备方法，其特征在于主要包含以下过程：SA的培养及其基因组DNA的提取：将SA接种在LB液体培养基中培养，取对数生长期的SA培养液离心处理，收集菌体，弃上清，菌体用TE缓冲液悬浮后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取SA基因组DNA，待用；SA肠毒素SEI基因扩增引物的设计：根据已有SA肠毒素SEI基因序列设计扩增SEI基因序列的特异性引物，在上游引物和下游引物5'端分别引入BamHI和HindIII限制性酶切位点，同时，设计扩增该基因的荧光定量RT‑PCR引物，SA肠毒素SEI基因的扩增与克隆：配制PCR反应体系，该反应体系包括：SA基因组DNA模板，10×...

【技术特征摘要】
1.一种检测SA肠毒素SEI的试剂的制备方法，其特征在于主要包含以下过程：SA的培养及其基因组DNA的提取：将SA接种在LB液体培养基中培养，取对数生长期的SA培养液离心处理，收集菌体，弃上清，菌体用TE缓冲液悬浮后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取SA基因组DNA，待用；SA肠毒素SEI基因扩增引物的设计：根据已有SA肠毒素SEI基因序列设计扩增SEI基因序列的特异性引物，在上游引物和下游引物5'端分别引入BamHI和HindIII限制性酶切位点，同时，设计扩增该基因的荧光定量RT-PCR引物，SA肠毒素SEI基因的扩增与克隆：配制PCR反应体系，该反应体系包括：SA基因组DNA模板，10×PCRbuffer，dNTPs，上游引物SEIFP1、下游引物SEIRP1，ddH2O，TaqDNA聚合酶，将所有试剂加入PCR反应管中并充分混匀，在不同温度段下进行PCR反应，用1-2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，将扩增产物电泳后进行回收，与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，经氨苄青霉素抗性平板筛选及菌液PCR验证后，获得重组质粒pT-SEI，SA肠毒素SEI基因的表达：按照分子克隆的方法，将含有SEI基因片段的重组质粒重组质粒pT-SEI与原核表达pET-28a(+)质粒分别用BamHI和HindIII限制性内切酶进行双酶切，然后分别回收目的片段和载体片段，用T4DNA连接酶进行过夜连接，并将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中36-38℃振荡培养12-24小时，构建pET-SEI重组表达质粒，按照分子克隆常规方法，将鉴定正确的pET-SEI重组表达质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21中，用IPTG诱导培养6-8h，离心收集菌液并加入LysisBuffer裂解菌体，液氮和40-45℃水浴反复冻融2-5次后进行超声破碎，每次8-12s，间歇8-12s，80-100次/周期，直至菌液清亮为止，得到SA重组肠毒素SEI，冷冻保存。2.根据权利要求1所述的检测SA肠毒素SEI的试剂的制备方法，其特征在于：SA的培养及其基因组DNA的提取为：将SA接种在LB液体培养基中，36-38℃培...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔军，孟庆玲，孟丹，乔梦凡，伍晔晖，王学领，曹旭东，刘昱成，王国超，田振中，张星星，蔡扩军，赵春光，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65