一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，属于食品检测领域。为了克服现有技术的不足，本发明专利技术提供一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，本发明专利技术通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后与四环素类抗体利用戊二醛方法进行偶联，得到四环素类抗体‑NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料并偶联四环素类抗原，然后构建上转换纳米粒子‑金纳米的荧光能量共振转移体系，从而准确检测牛奶中四环素类药物残留量。本发明专利技术能得到粒径较小，单分散性好，荧光信号强的上转换纳米材料，可以通过上转换纳米材料的荧光变化量来定量四环素类药物的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法
本专利技术涉及一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，属于食品检测领域。
技术介绍
在食品安全检测中，经常利用荧光染料与研究对象进行结合形成化合物，然后通过化合物的荧光特性反映研究对象性能的信息。但是这些结合后的化合物在紫外波段下发生激发光时，有可能会使生物组织及其肽、蛋白质、核酸等产生强烈的背景荧光。某些荧光素还会产生生物学毒性，导致抗原或抗体的灵敏度和选择性下降，影响实际检测效果或严重危害到被检测的生物体。上转换发光技术就是利用功能化的上转换发光材料与生物分子结合形成良好的低毒性、抗光漂白、方便的标记物，对有害分子的进行检测，从而解决传统化学荧光染料的局限。食品安全检测中运用上转换发光材料技术，必须先对上转换发光材料进行氨基化、醛基化、羧基化的表面修饰，增强上转换发光材料在水溶液中的分散性和稳定性，使其易于和生物大分子相结合，便于运用在食品安全检测中。利用戊二醛方法，标记四环素类抗体，形成标记物。上转换发光技术是把上转换发光材料NaYF4：Yb，Er作为能量供体，金纳米粒子作为能量受体，分别结合四环素类抗体和抗原，由于供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，抗原抗体也会发生免疫反应，因此可以缩短供体和受体分子之间的距离，从而实现能量淬灭。随后加入一定量的游离抗原，让游离的抗原和金纳米材料上的抗原形成免疫竞争，使得上转换发光材料和金纳米形成的荧光能量共振转移体系被破坏，荧光淬灭消失，荧光量增加，因此可以根据荧光量的变化对游离抗原进行量化。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，本专利技术通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后与四环素类抗体利用戊二醛方法偶联，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料并偶联四环素类抗原，然后构建上转换纳米粒子-金纳米的能量共振转移体系，本专利技术能得到粒径较小，单分散性好，荧光信号强的上转换纳米材料，可以通过其荧光变化量来定量四环素类药物的含量。本专利技术通过下述技术方案实现上述技术效果：一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，是通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后和四环素类抗体利用戊二醛方法偶联，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料，偶联四环素类抗原得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，然后构建上转换纳米粒子-金纳米的能量共振转移体系，通过测定荧光强度确定四环素类抗原的浓度。本专利技术所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，具体包括下述步骤：1)NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备量取YNO3溶液、YbNO3溶液和ErNO3溶液混合均匀，缓慢加入柠檬酸钠溶液后超声混匀；向其中缓慢滴加NaF溶液直至混合溶液中有白色沉淀出现，将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均相反应器中，180℃保温反应4h，冷却至室温后离心，将沉淀物洗涤干燥，即得NaYF4：Yb，Er纳米粒子；2)功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：将NaYF4：Yb，Er纳米粒子加入正丙醇中，超声磁力搅拌后转移至35℃的恒温水浴中，向其中滴入氨水溶液，继续磁力搅拌1h；依次向其中缓慢滴加TEOS溶液反应4h；向其中加入APTES溶液持续搅拌1h后离心取沉淀物，洗涤、干燥，即得功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子；3)四环素类抗体连接取功能化的NaYF4：Yb，Er的纳米粒子溶解到PBS溶液中，缓缓加入戊二醛溶液和硼氢化钠，混合均匀后室温下缓慢振荡反应1h后离心，沉淀物使用PBS溶液洗涤后重新分散在PBS溶液中，加入四环素类抗体和硼氢化钠，室温下振荡反应1h后加入Tris封闭剂，继续振荡反应1h后离心，沉淀物洗涤后分散在PBS溶液中，4℃保存备用，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液；4)合成金纳米磁力搅拌下将柠檬酸钠溶液快速加入到氯金酸溶液中，水浴中搅拌直至溶液呈现酒红色，加热回流30min，冷却至室温得冷却溶液，将PVP溶液加入到冷却溶液中室温搅拌24h，即得金纳米溶液，4℃避光保存；5)金纳米和抗原连接金纳米溶液用PBS溶液调到pH为8.0，冰水浴中搅拌状态下加入四环素类抗原搅拌反应1h；向其中加入BSA封闭剂后继续搅拌反应1h，4℃下离心分离，沉淀物使用PBS洗涤后，分散在PBS溶液中，得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，4℃保存备用；6)确定以及优化四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液为基础的四环素类荧光能量共振转移体系：在试管中加入定量游离四环素类抗原，然后分别向其中加入等量的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液，反应0.5h后，接着分别加入一系列不同量的四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，将体系置于摇床上缓慢振摇0.5h后，放入荧光分光光度计上进行荧光测定，通过荧光的变化量来确定体系中四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液的最适浓度，形成良好的上转换纳米材料-金纳米材料体系；7)确定四环素类药物在牛奶中的检测范围向牛奶中分别掺入不同含量四环素类抗原，然后分别加入等量的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液混合反应0.5h，接着加入适量四环素类抗原-BSA-金纳米溶液。最后向其中加入PBS溶液，使得最终溶液为200μL后置于摇床振荡反应40min，进行荧光测定，根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，确定四环素类药物的检测范围，得到相关线性关系。8)按照步骤7)中的检测范围，检测一定范围内含有其他抗生素类样品的荧光强度，并根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，观察该方法是否具有特异性，能否能在检测范围内检测出含有四环素类抗生素的样品。优选地，所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，具体包括下述步骤：1)NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备分别取Y2O3，Yb2O3和Er2O3，向其中加入过量的HNO3溶液加热反应，溶液蒸发后加入去离子水定容分别得到浓度分别为1mol/L的YNO3溶液，0.2mol/L的YbNO3溶液和0.02mol/L的ErNO3溶液；量取YNO3溶液2.5mL、YbNO3溶液3mL和的ErNO3溶液3mL混合均匀，缓慢加入1mmol的柠檬酸钠溶液后超声后混合均匀；磁力搅拌下缓慢滴加1.0mol/L的NaF溶液直至混合溶液中有白色沉淀出现，使用NaOH溶液将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均相反应器中，180℃保温反应4h，冷却至室温并将混合液离心，离心转速为10000rpm，离心时间为10min；使用无水乙醇洗涤一次，然后再用双蒸水洗涤三次；洗涤完毕后置于60℃恒温干燥12h，即得NaYF4：Yb，Er纳米粒子；2)功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：将20mgNaYF4：Yb，Er粉末加入到30mL的正丙醇溶液，超声磁力搅拌40min，向其中滴入1.25mL氨水溶液和10mL水，然后转移至35℃的恒温水浴中磁力搅拌1h；向其中缓慢滴加10μLTEOS溶液和正丙醇的混合溶液，继续反应4h；接着将0.1mLAPTES和正本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其是通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后和四环素类抗体利用戊二醛方法偶联，得到四环素类抗体‑NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料，偶联四环素类抗原得到四环素类抗原‑BSA‑金纳米溶液，然后构建上转换纳米粒子‑金纳米的能量共振转移体系，通过测定荧光强度确定四环素类抗原的检测范围。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其是通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后和四环素类抗体利用戊二醛方法偶联，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料，偶联四环素类抗原得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，然后构建上转换纳米粒子-金纳米的能量共振转移体系，通过测定荧光强度确定四环素类抗原的检测范围。2.根据权利要求1所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：1)NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：量取YNO3溶液、YbNO3溶液和ErNO3溶液混合均匀，缓慢加入柠檬酸钠溶液后超声混匀；向其中缓慢滴加NaF溶液直至混合溶液中有白色沉淀出现，将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均相反应器中，180℃保温反应4h，冷却至室温后离心，将沉淀物洗涤干燥，即得NaYF4：Yb，Er纳米粒子；2)功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：将NaYF4：Yb，Er纳米粒子加入正丙醇中，超声磁力搅拌后转移至35℃的恒温水浴中，向其中滴入氨水溶液，继续磁力搅拌1h；依次向其中缓慢滴加TEOS溶液反应4h；加入APTES溶液持续搅拌1h后离心取沉淀物，洗涤、干燥，即得功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子；3)四环素类抗体连接：取功能化的NaYF4：Yb，Er的纳米粒子溶解到PBS溶液中，缓缓加入戊二醛溶液和硼氢化钠，混合均匀后室温下缓慢振荡反应1h后离心，沉淀物使用PBS溶液洗涤后重新分散在PBS溶液中，加入四环素类抗体和硼氢化钠，室温下振荡反应1h后加入Tris封闭剂，继续振荡反应1h后离心，将沉淀物洗涤后分散在PBS溶液中，4℃保存备用，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液；4)合成金纳米：磁力搅拌下将柠檬酸钠溶液快速加入到氯金酸溶液中，水浴中搅拌直至溶液呈现酒红色，加热回流30min，冷却至室温得冷却溶液，将PVP溶液加入到冷却溶液中室温搅拌24h，即得金纳米溶液，4℃避光保存；5)金纳米和抗原连接：用PBS溶液将金纳米溶液pH值调为8.0，冰水浴中搅拌状态下加入四环素类抗原搅拌反应1h；再向其中加入BSA封闭剂后继续搅拌反应1h，4℃下离心分离，沉淀物使用PBS洗涤后，分散在PBS溶液中，得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，4℃保存备用；6)确定以及优化四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液为基础的四环素类荧光能量共振转移体系：在试管中加入定量游离四环素类抗原，然后分别向其加入等量的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液，反应0.5h后，接着分别加入一系列不同量的四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，将体系置于摇床上缓慢振摇0.5h后，放入荧光分光光度计上进行荧光测定；对照组试管中不添加游离的抗原溶液，加入与实验组相同的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原偶联的金纳米溶液，反应后也进行荧光测定；通过实验组和对照组的荧光变化量来确定体系中四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液的最适浓度，形成良好的上转换纳米材料-金纳米材料体系；7)确定四环素类药物在牛奶中的检测范围：在牛奶中分别掺入不同含量的四环素类抗原溶液，然后分别加入等量的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液混合反应0.5h，接着加入适量四环素类抗原-BSA-金纳米溶液；最后向其中加入PBS溶液，使得最终溶液为200μL后，置于摇床振荡40min后进行荧光测定，根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，确定四环素类药物的检测范围，得到相关线性关系；8)按照步骤7)中的检测范围，检测一定范围内含有其他抗生素类样品的荧光强度，并根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，观察该方法是否具有特异性，能否在检测范围内检测出含有四环素类抗生素的样品。3.根据权利要求1所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其特征在于，所述的方法具体包括下述步骤：1)NaYF4：Yb，Err纳米粒子的制备分别取Y2O3，Yb2O3和Er2O3，向其中加入过量的HNO3溶液加热反应，待溶液蒸发后加入去离子水定容，得到浓度分别为1mol/L的YNO3溶液，0.2mol/L的YbNO3溶液和0.02mol/L的ErNO3溶液；量取YNO3溶液2.5mL、YbNO3溶液3mL和ErNO3溶液3mL混合均匀，缓慢加入1mmol的柠檬酸钠溶液后超声后混合均匀；磁力搅拌下缓慢滴加1.0mol/L的NaF溶液直至混合溶液中有白色沉淀出现，使用NaOH溶液将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均相反应器中，180℃保温反...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕水莲，梁紫璐，罗永文，王宗源，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44