一种以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的制备方法技术

一种以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的制备方法属于生物制药技术；包括：①、将温控裂解质粒转化到大肠杆菌内，培养至对数生长期进行诱导表达，得到无活性大肠杆菌菌影菌液；②、将诱导后无活性大肠杆菌菌影菌液离心处理取沉淀物，将沉淀物制备成无活性大肠杆菌菌影冻干粉；③、将紫杉醇配制成溶液；④、将无活性大肠杆菌菌影冻干粉与紫杉醇溶液共孵育后，离心取沉淀物，得无活性大肠杆菌菌影装载紫杉醇成份的紫杉醇药物；本药物采用无活性的大肠杆菌菌影为紫杉醇药物的载体，具有良好的缓释性、靶向性和免疫刺激性，提高了紫杉醇药物抗癌治疗效果。

Preparation method of paclitaxel loaded with Escherichia coli as carrier

A preparation method of paclitaxel loaded with Escherichia coli belongs to the bio pharmaceutical technology, including: 1. Transforming the thermoplasmids of temperature control into Escherichia coli to induce expression in logarithmic growth period and obtain anactive Escherichia coli bacteria liquid; 2. The inactive Escherichia coli will be induced. The precipitate was prepared by liquid centrifugation, and the precipitate was prepared into an inactive Escherichia coli freeze dry powder; (3) paclitaxel was prepared into a solution. (4) after incubation of the inactive Escherichia coli freeze dry powder and paclitaxel solution, the precipitate was centrifuged and the paclitaxel drug was loaded without the active Escherichia coli shadow containing paclitaxel. This drug used inactive Escherichia coli as a carrier of taxol, with good release, targeting and immune irritation, and improved the antitumor effect of paclitaxel drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的制备方法
本专利技术属于生物医学药物与微生物领域，具体地说，涉及一种以大肠杆菌菌影为载体装载抗癌药物的制备方法。
技术介绍
菌影(bacterialghostBG)是一种由phiX174噬菌体裂解E基因在细菌体内表达后形成不包含核酸、核糖体以及其他内容物的空细菌体。BG保留了细菌型态的同时，也保留了细菌表面的抗原结构，这使BG可以有效的刺激机体产生体液免疫与细胞免疫应答。裂解E基因表达形成的蛋白会在细菌胞膜上留下溶菌孔道，DNA质粒或药物可以通过孔道装载到BG内部，因其所具有的这些特点，菌影具有良好的靶向性。紫杉醇(PTX)是一种广泛用于临床治疗卵巢癌和乳腺癌的抗肿瘤药物。紫杉醇的水溶性差，注射剂型中用经纯化的聚氧乙烯蓖麻油和USP级的无水乙醇接近等比例的混合溶剂作为溶剂，但是在应用过程中，出现神经毒性、肝脏毒性等一系列严重的不良反应，所以将紫杉醇装载于适合的载体，以改善药物溶解性，减少不良反应是急需解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种具有缓释性、靶向性的以无活性大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的制备方法，达到提高紫杉醇抗肿瘤治疗效果的目的。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:一种以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的制备方法，所述方法包括以下步骤：①、将温控裂解质粒转化到大肠杆菌内，在25—30℃、200—220r/min条件下培养至对数生长期进行诱导表达，排出内容物，保留天然抗原，得到无活性大肠杆菌菌影菌液；②、将诱导后无活性大肠杆菌菌影菌液离心处理取沉淀物，将沉淀物通过冻干机加工制备成无活性大肠杆菌菌影冻干粉；③、将紫杉醇配制成溶液；④、将无活性大肠杆菌菌影冻干粉与紫杉醇溶液在190—210r/min、室温22—27℃、避光12h条件下共孵育后，离心取沉淀物，得到无活性大肠杆菌菌影装载紫杉醇成份的紫杉醇药物。本专利技术构建一种紫杉醇药物缓释系统，以大肠杆菌菌影作为一种药物载体，与传统的缓释载体相比，其对肿瘤细胞具有靶向性，可以增加紫杉醇抗肿瘤效果，这为之后应用于临床提供基础性理论依据。与现有其它类型的药物载体相比较，本专利技术有以下优点：所使用的药物载体为大肠杆菌菌影，其内容物排出留有空间装载药物且无生命活性，并保留了菌体天然抗原。天然抗原不仅会刺激机体产生免疫反应，而且脂多糖(LPS)会与一些癌细胞表面所表达的toll样受体(TLRs)产生结合与反应，这样也具有了被动的靶向性。水溶性和脂溶性的抗癌药物都可装载于无活性大肠杆菌菌影中，因此，具有缓释性、靶向性和免疫刺激性的紫杉醇药物缓释系统具有良好的应用前景。附图说明图1是菌影吸附于MCF—7(MCF—7乳腺肿瘤细胞)荧光染色图片；图2是药物释放曲线图；图3是MCF—7活性抑制柱状图。具体实施方式下面对本专利技术实施方案进行详细描述。一种以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的制备方法，所述方法包括以下步骤：①、将温控裂解质粒转化到大肠杆菌内，在25—30℃、200—220r/min条件下培养至对数生长期进行诱导表达，排出内容物，保留天然抗原，得到无活性大肠杆菌菌影菌液；②、将诱导后无活性大肠杆菌菌影菌液离心处理取沉淀物，将沉淀物通过冻干机加工制备成无活性大肠杆菌菌影冻干粉；③、将紫杉醇配制成溶液；④、将无活性大肠杆菌菌影冻干粉与紫杉醇溶液在190—210r/min、室温22—27℃、避光12h条件下共孵育后，离心取沉淀物，得到无活性大肠杆菌菌影装载紫杉醇成份的紫杉醇药物。实施例：将温控裂解质粒转化到大肠杆菌内，在28℃、210r/min条件下对大肠杆菌培养至对数生长期进行诱导表达，排出内容物，保留天然抗原，得到无活性大肠杆菌菌影菌液；将诱导后的无活性大肠杆菌菌影菌液离心取沉淀物，将沉淀物通过冻干机加工制备成无活性大肠杆菌菌影冻干粉；将紫杉醇配制成溶液；称取1mg无活性大肠杆菌菌影冻干粉，平行样共3组，分别与3组浓度为2mg/ml的200ml紫杉醇溶液共孵育，条件为200r/min、室温25℃、避光12h，离心取沉淀物，对上清紫杉醇溶液重新检测药物浓度后，做差计算得到1mg无活性大肠杆菌菌影装载紫杉醇药物成份含量63mg的以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物。制药效果验证MCF-7细胞在细胞瓶中生长至80％左右后消化吹吸，再接种于6孔板上(105/孔)，过夜培养后镜下观察，视野内细胞基本均匀铺满时加入用培养基稀释的FITC—BG(菌影细胞比例100:1、绿色荧光)，补加培养基至2ml/孔，37℃下避光孵育20min。孵育完毕后，取出6孔板用PBS洗板三次，每次15min。加入cm-Dil细胞染液(红色荧光)，使其工作浓度为2μg/ml(培养基2ml/孔)。37℃、避光孵育30min，之后转入4℃、孵育15min，孵育完毕再用PBS洗板3次，吸出残留液体，荧光显微镜下观察。见图1，可见经过短时间共同孵育，并且多次洗板后，依然可见菌影(BG)吸附于细胞周围。利用流动透析法检测游离组和药物搭载组紫杉醇释放情况。实验前先根据药典配置释放介质溶液(磷酸缓冲液+0.5％SDS，PH＝7.4)，选取10、30、50、70、100μg/ml浓度绘制标准曲线。游离组和搭载组分别取1mg紫杉醇装载于透析袋内，再将透析袋置于50ml离心管的释放介质中，200r/min，室温加速释放。每组3个样本做为平行对照。按照各时间点每次取出1ml释放介质检测其浓度，再加入1ml补充。将各个时间点所测得的浓度按比例计算后得出药物释放量，从而绘制药物释放曲线。见图2，可见以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇载药组的药物释放时间长于游离组。MCF-7细胞系复苏活化后按1000个/孔；BG—PTX低浓度组(10ng/μl)、BG—PTX高浓度组(100ng/μl)、PTX低浓度组(10ng/μl)、PTX高浓度组(100ng/μl)、BG空载体低比例组(菌影细胞比例100:1)、BG空载体高比例组(菌影细胞比例1000:1)、空白细胞对照组共7组；每组5个平行样接种于3个96孔板(3个时间点)，每孔加入100ulDMEM(10％胎牛血清)培养液放入CO2恒温培养箱过夜培养。次日按上述分组分别加入游离药物、搭载药物、空白载体作用6h、12h、24h。之后，去掉原培养液，每孔加入用含有cck-8试剂的培养液(10％浓度)100ul，在培养箱内避光孵育2.5h，取出后用酶标仪测定在450nm处的吸光度值，按照细胞生长抑制率(IR)公式进行计算：IR(％)＝[(对照组OD值—实验组OD值)/对照组OD值]×100％。见图3，可见以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的装载组细胞活性抑制要优于对比的游离组药物，并且无细胞毒性，提高了紫杉醇药物抑制癌细胞的能力和效果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的制备方法，所述方法包括以下步骤：①、将温控裂解质粒转化到大肠杆菌内，在25—30℃、200—220r/min条件下培养至对数生长期进行诱导表达，排出内容物，保留天然抗原，得到无活性大肠杆菌菌影菌液；②、将诱导后无活性大肠杆菌菌影菌液离心处理取沉淀物，将沉淀物通过冻干机加工制备成无活性大肠杆菌菌影冻干粉；③、将紫杉醇配制成溶液；其特征在于：④、将无活性大肠杆菌菌影冻干粉与紫杉醇溶液在190—210r/min、室温22—27℃、避光12h条件下共孵育后，离心取沉淀物，得到无活性大肠杆菌菌影装载紫杉醇成份的紫杉醇药物。

【技术特征摘要】
1.一种以大肠杆菌菌影为载体装载紫杉醇药物的制备方法，所述方法包括以下步骤：①、将温控裂解质粒转化到大肠杆菌内，在25—30℃、200—220r/min条件下培养至对数生长期进行诱导表达，排出内容物，保留天然抗原，得到无活性大肠杆菌菌影菌液；②、将诱导后无活性大肠杆菌菌影菌液离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云，只勇，张震，雷磊，牟婧，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23