一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用。一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记，该InDel分子标记为以SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物对耐盐豇豆品种苏紫41基因组DNA进行PCR扩增得到的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。用于扩增本发明专利技术所述的InDel分子标记的引物对，上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。利用该标记及其引物进行辅助选择，可以快速筛选豇豆耐盐株系用于豇豆耐盐性育种，提高育种的准确性和选择效率，节约成本。

InDel markers linked to salt tolerance traits of cowpea and their primers and Application

The invention discloses a InDel molecular marker closely linked to the salt tolerance related traits of cowpea and its primers and application. A InDel molecular marker closely linked to the salt tolerance related traits of cowpea, the InDel molecule was labeled as the nucleotide sequence of SEQ ID, which was amplified by the upstream primers of SEQ ID NO.1 and the downstream primers of SEQ ID NO.2 for the amplification of the genomic DNA of the salt tolerant cowpea variety Suzi 41. Primer pairs for amplifying the InDel molecular markers described in the invention are shown upstream primers such as SEQ ID NO.1, and downstream primers such as SEQ ID NO.2 are shown. Using the marker and its primers for auxiliary selection, the salt tolerance strains of cowpea can be quickly screened for salt tolerance breeding of cowpea, and the accuracy and efficiency of selection can be improved and the cost saving can be saved.

【技术实现步骤摘要】
一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用
本专利技术属于分子生物学及遗传育种
,具体涉及一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用。
技术介绍
据联合国教科文组织(UNESCO)和联合国粮农组织(FAO)不完全统计，全世界盐渍土面积约10亿hm2(王遵亲,1993)。我国盐渍土面积约1亿hm2，这些盐渍土是我国重要的土地资源的一部分，尤其是在北方地区和南方沿海地区(时津霞等,2004；Stapies,1984)。中国的豇豆种植面积常年维持在33万hm2以上，主要产区为河北、河南、江苏、浙江、安徽、四川、重庆、湖北、湖南、广西等省(自治区)(潘磊等，2014)。豇豆经济价值较高，其豆芽、幼苗、嫩荚都可作蔬菜食用，是解决夏秋淡季蔬菜供应的重要蔬菜作物之一。我国沿海地区是豇豆的重要产地，沿海地区海水中的盐分通过地上和地下途径进入土壤，而且处于较低的纬度，土壤的水分蒸发较多，也存在土壤盐碱问题(张舟等，2014)。在豇豆的分子标记研究中，大多采用基于PCR(Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)的DNA分子标记。利用显性分子标记，如RAPD、ISSR等，已经筛选获得一批重复性好、稳定可靠的分子标记引物(陈禅友等，2008；ChenCY,etal.,2010)。近年来，SSR和SNP等共显性分子标记的应用备受青睐。2009年首次报道了基于EST序列的1375个SNP位点(MucheroW，etal.,2009)。Li等(2001)率先开发出27个SSR标记应用于豇豆研究。Gupta等于2010年从NCBI数据库(http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/)的豇豆unigenes序列中设计筛选出102个SSR标记。Xu等于2010年则从豇豆基因组数据库HarvEST(http://www.harvest-web.org/)和CGKB(http://cowpeagenomics.med.virginia.edu/CGKB)中发掘出172个多态性豇豆SSR分子标记(45个EST-SSR标记和127个gSSR标记)。InDe1标记是指由核苷酸水平上碱基的插入或缺失多态性，在植物基因组中有较高的分布频率，具有遗传稳定性高、分布广、多态性强等优点，并且InDel分布密度远高于SSR，理论上讲SSR标记包含在InDel标记范围内。标记辅助育种需要高密度遗传连锁图，但利用豇豆转录组数据开发InDel标记的研究还未见报道。目前对豇豆耐盐相关的QTL定位研究较少，通常检测出的QTL数目较多，但效应值较小且重复性不好，较难在豇豆育种中应用。本研究通过QTL定位，旨在找到QTL区间内与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的分子标记，同时将分子标记用于豇豆耐盐育种中。本研究通过QTL定位，旨在筛选出与豇豆耐盐相关性状耐盐级别(STR)和叶绿素含量(SPAD)的QTLs位点和InDel分子标记，用于豇豆耐盐育种的分子标记辅助选择。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于利用耐盐和盐敏感两个豇豆品种配置杂交组合，F1代自交后得到F2群体，对F2群体进行耐盐的表型鉴定。这两个亲本材料进行转录组测序，将转录组组装序列进行BLAST比对，筛选有插入/缺失(InDel)的转录本，开发InDel标记。利用自主开发的InDel分子标记构建遗传图谱，并根据耐盐表型数据进行QTL定位。这为豇豆耐盐相关性状和农艺性状的基因定位、遗传多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析与高密度遗传连锁图谱的构建和分子标记辅助选择育种提供更多新的InDel标记，弥补目前豇豆InDel标记较为缺乏的不足。一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记，该InDel分子标记为以SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物对耐盐豇豆品种苏紫41基因组DNA进行PCR扩增得到的SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。用于扩增本专利技术所述的InDel分子标记的引物对。所述的引物对优选上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示。与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记在豇豆遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记在分子育种筛选耐盐和/或高叶绿素含量豇豆品种中的应用。所述的引物对在豇豆遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。所述的引物对在分子育种筛选耐盐和/或高叶绿素含量豇豆品种中的应用。本专利技术所述的一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记的开发方法，包括以下步骤：1)利用耐盐豇豆品种苏紫41为母本和盐敏感苏豇1419为父本进行杂交，F1代自交获得F2代分离群体；2)采用十六烷基三甲基溴化铵法提取苏紫41、苏豇1419、F1代和F2代分离群体单株的叶片总DNA；3)利用llluminaHiseq2000平台对苏紫41和苏豇1419进行转录组测序；4)将转录组组装序列进行BLAST比对，筛选有插入/缺失的转录本；5)挑选插入/缺失的序列长度差异相对较大的序列，结合引物设计软件开发InDel标记引物；6)利用自主开发的InDel引物，对两亲本和F1代进行PCR扩增，产物在8％聚丙烯凝胶中电泳、显影、染色和带型识别，筛选亲本具有多态性及F1代具有共显性的InDel标记；7)利用5)的InDel标记对F2分离群体进行分子标记基因型分析，利用Joinmap3.0软件进行F2代群体遗传图谱的构建，作图参数设为重组率<0.4，LOD>1.0；并用WinQTLCartographer2.5软件进行数量性状位点定位，LOD阈值用1000次的置换测验确定，概率水平P＝0.05，在第11连锁群上检测到主效QTL位点qSTR-11和qSPAD-11的存在，分别解释耐盐级别STR和叶绿素含量SPAD的7.0％和7.1％表现变异，距主效QTL位点qSTR-11和qSPAD-11距离最近的Indel标记为VUIn282，其距离为13.7和9.23；该分子标记的引物序列为VUIn282_F:SEQIDNO.1，VUIn282_R:SEQIDNO.2；此InDel标记在苏紫41的扩增片段为131个bp:AGCCTGGATATAATCCAAACACTTTTTTTCCGAAGGCGATTGACAACACTTTCTTTTTGCACTAGATAATATGCTTCTAGTAATTTGATAAAAATCATTGAAAATTCTTGTTCTTTGCTTTGGTTGCTTTC(SEQIDNO.3)。有益效果：利用耐盐和盐敏感两个豇豆品种配置杂交组合，F1代自交后得到F2群体，对F2群体进行耐盐的表型鉴定。这两个亲本材料进行转录组测序，将转录组组装序列进行BLAST比对，筛选有插入/缺失(InDel)的转录本，开发InDel标记。本专利技术通过开发的InDel标记及其引物对获得一个与豇豆耐盐相关性状耐盐级别(STR)和叶绿素含量(SPAD)的QTL。因此，利用该标记及其引物进行辅助选择，可以快速筛选豇豆耐盐株系用于豇豆耐盐性育种，提高育种的准确性和选择效率，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于该InDel分子标记为以SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物对耐盐豇豆品种苏紫41基因组DNA进行PCR扩增得到的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于该InDel分子标记为以SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物对耐盐豇豆品种苏紫41基因组DNA进行PCR扩增得到的SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。2.用于扩增权利要求1所述的InDel分子标记的引物对。3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示。4.与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记在豇豆遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记在分子辅助育种筛选耐盐和/或高叶绿素含量豇豆品种中的应用。6.权利要求2或3所述的引物对在豇豆遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求2或3所述的引物对在分子育种筛选耐盐和/或高叶绿素含量豇豆品种中的应用。8.权利要求1所述的一种与豇豆耐盐相关性状紧密连锁的InDel分子标记的开发方法，其特征在于包括以下步骤：1)利用耐盐豇豆品种苏紫41为母本和盐敏感苏豇1419为父本进行杂交，F1代自交获得F2代分离群体；2)采用十六烷基三甲基溴化铵法提取苏紫41、苏豇1419、F1代和F2代分离群体单株的叶片总...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红梅，许文静，刘晓庆，陈新，陈景斌，陈华涛，崔晓艳，袁星星，薛晨晨，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32