一种制备桦褐孔菌多糖的方法技术

本发明专利技术提供一种制备桦褐孔菌多糖的方法，该方法包括如下步骤：(1)桦褐孔菌子实体粉碎后用乙醇超声脱脂，过滤，滤渣挥干酒精后，沸水提取3次，合并滤液后，减压浓缩至料液比为1g：12mL的提取液；(2)提取液中加入硫酸铵溶解，然后加入0.5‑3倍体积的叔丁醇，恒温30℃反应15‑90min，离心分层；(3)将下层水相使用截留分子量为8000‑10000的透析袋流水透析，透析袋内溶液浓缩后干燥，可得到纯化的桦褐孔菌多糖。本发明专利技术制备得到的多糖具有很强的抗氧化能力和体外免疫活性。

A method for preparation of Polysaccharide from Betula oroborus

The present invention provides a method for preparing polysaccharide of Betula norus. The method includes the following steps: (1) after pulverization of birch fungus fruit body, ethanol ultrasonic degreasing, filtration, and filtration of filtration residue after drying alcohol, the boiling water is extracted 3 times, after the filtrate is merged, the decompression is concentrated to the extract of 1g:12mL, and (2) the extraction solution is added to the solution of ammonium sulfate. At the same time, 0.5 tertiary butyl alcohol with 3 times volume was added, the reaction was 15 90min at constant temperature and centrifuge stratification; (3) the lower water phase was dialysed with a dialysis bag with a molecular weight of 8000, and the solution was concentrated in the dialysis bag, and the purified polysaccharide was obtained. The polysaccharide prepared by the invention has strong antioxidant capacity and immune activity in vitro.

【技术实现步骤摘要】
一种制备桦褐孔菌多糖的方法
本专利技术涉及食用菌提取领域，具体的说涉及一种制备特定分子量桦褐孔菌多糖的方法。技术背景桦褐孔菌属于担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科，是一种传统的药用真菌。主要分布于北纬45～50°之间的俄罗斯、北欧、波兰、日本北海道以及中国黑龙江大小兴安岭和吉林长白山等高寒地区，由于其特殊的生长环境，被冠以“森林中的黑钻石”、“奇幻的蘑菇”美称。自十六世纪以来，在世界多个国家，桦褐孔菌广泛用于治疗多种消化道癌症(如胃癌、肝癌和肠癌等)，心脏病和糖尿病等疑难杂症。多糖是桦褐孔菌最重要的活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗突变、抗哮喘、增强免疫力等多种生物活性。近年来，随着药品和保健食品的兴起，桦褐孔菌在医药和保健品等领域表现出的广阔应用前景及开发价值引起了人们的兴趣。目前国内外学者们对食用菌多糖的提取进行了很多研究，主要的提取方法包括浸渍提取法、超声波提取法、微波辅助提取方法、高压脉冲电场辅助提取法等，但是这些提取方法复杂，溶剂消耗量大、高温高压和较长处理时间等，且需要后续多个分离纯化步骤，难以大规模地应用。三相法作为一种新的蛋白质分离纯化技术，是一种安全有效的绿色分离技术，该方法包括盐析、等电点沉淀及溶剂沉淀技术，将有机溶剂(一般为叔丁醇)和盐与提取液反应，搅拌离心后，混合物分为三相，其中上相为有机溶剂相(即叔丁醇相)，下相为水相，中间相为蛋白相。三相分离技术可以选择性的将需要的蛋白分离到中间相，而其余的成分分配到其它相中。大多研究者，主要将研究目标放在蛋白相中，使用三相法从食药用菌中分离提取纯化多糖尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备桦褐孔菌多糖的方法，该方法包括如下步骤：(1)桦褐孔菌子实体粉碎后用乙醇超声脱脂，过滤，滤渣挥干乙醇后，沸水提取3次，合并滤液后，减压浓缩至料液比为1g:12mL(桦褐孔菌子实体粉质量：水的体积)的提取液；(2)提取液中加入硫酸铵(硫酸铵在溶液中的质量百分比为10％-60％)溶解，然后加入0.5-3倍体积的叔丁醇，恒温30℃反应15-90min，离心分层；(3)将下层水相使用截留分子量为8000-10000的透析袋流水透析，透析袋内溶液浓缩后干燥，可得到纯化的桦褐孔菌多糖。三相分离法是一种用于分离纯化蛋白质的方法，对含有多糖的水相研究至今未见报道，本专利技术利用三相法获得桦褐孔菌多糖，可以快速高效简便地获得约为4-5万分子量的桦褐孔菌多糖。本专利技术提供一种新的从桦褐孔菌中获得特定分子量活性多糖的方法，该方法设备简单，操作简便，由该方法制得的桦褐孔菌多糖分子量约为4-5万，提取率可达2.20％以上，并且有较高的抗氧化活性和体外免疫活性。附图说明图1桦褐孔菌多糖分子量液相图谱图2本专利技术实例中桦褐孔菌多糖对DPPH·自由基的清除率的影响图3本专利技术实例中桦褐孔菌多糖等价抗氧化能力的测定图4本专利技术实例中桦褐孔菌多糖对巨释细胞RAW264.7释放NO的影响具体实施方式为了对本专利技术的
技术实现思路
，功效特点有更加具体和深入的了解，现结合实例对本专利技术的内容进行详述：材料：桦褐孔菌子实体采自西藏林芝色拉山地区，经北京林业大学和西藏农牧学院高原生态研究所鉴定。材料预处理：将桦褐孔菌子实体清洗干净后，烘箱50℃干燥至恒重。将样品粉碎过10目筛，得到桦褐孔菌子实体粗粉。实施例一乙醇脱脂：50g桦褐孔菌用500mL乙醇超声1h，过滤后，滤渣重复两次提取，滤渣挥干乙醇后备用；粗多糖提取：上述桦褐孔菌子实体滤渣沸水(100℃)提取1h，过滤后，重复提取2次，合并提取液后减压浓缩至600mL的料液比。取10mL的桦褐孔菌粗多糖提取液在常温下加入硫酸铵1g在涡旋振荡仪震荡溶解30s，加入10mL的叔丁醇，将萃取管放置于30℃的恒温震荡仪以400rpm的速度振荡30min，混合物离心(2700g，15min)形成三个澄清的相。将下层水相使用截留分子量为8000-10000的透析袋(sigma公司)流水透析以除去小分子盐类，浓缩后冷冻干燥，可得到30.30mg纯化的桦褐孔菌多糖。多糖的提取率为1.80±0.05％，分子量为5.05×104(±9.08％)Da。高效液相(HPLC)检测桦褐孔菌多糖分子量：2695Waters高效液相色谱系统2695HPLCPump,On-lineDegasser,2414RefractiveIndexDetector、Waters2487UVDualWavelengthAbsorbanceDetector、multipleanglelaserlightscatteringdetector和differentialpressureviscometerdetector平行检测，TSKPWXL6000和4000柱串联，流动相为0.15MNaNO3and0.05MNaH2PO4，0.02％叠氮钠，pH＝7，流速为0.5mL/min，待测桦褐孔菌多糖样品在临用前配成5mg/mL的溶液，12000rpm离心10分钟，上清进样，进样量为100μl，液相图谱呈现单一对称峰，使用Astra数据分析软件对光散射数据进行采集和分析其分子量为5.05×104(±9.08％)Da。实施例二乙醇脱脂：50g桦褐孔菌用500mL乙醇超声提取1h，过滤后，滤渣重复提取两次，滤渣挥干乙醇后备用；粗多糖提取：桦褐孔菌子实体残渣沸水(100℃)提，过滤后，重复提取2次，合并提取液后减压浓缩至600mL的料液比。取10mL的粗多糖提取液在常温下加入硫酸铵2g在涡旋振荡仪震荡溶解30s，然后加入25ml的叔丁醇，将萃取管放置于30℃的恒温震荡仪中400rpm的速度振荡30min。混合物离心(2700g，15min)形成三个澄清的相。将获得的下层水相使用截留分子量为8000-10000的透析袋流水透析以除去小分子盐，浓缩后冻干干燥，可得到30.25mg纯化的桦褐孔菌多糖。多糖的提取率最高为1.84±0.06％，分子量为3.84×104(±12.06％)Da。实施例三乙醇脱脂：50g桦褐孔菌用500mL乙醇超声提取1h，过滤后，滤渣重复提取两次，滤渣挥干乙醇后备用；粗多糖提取：桦褐孔菌子实体的残渣用沸水(100℃)提取，过滤后，滤渣重复提取2次，合并滤液后减压浓缩至600mL的料液比。取10mL的粗多糖提取液在常温下加入2g硫酸铵在涡旋振荡仪震荡溶解30s，然后加入10mL的叔丁醇。将萃取管以400rpm的速度放置于30℃的恒温震荡仪中放置30min。混合物离心(2700g，15min)形成三个澄清的相。将获得的下层水相进行流水透析以除去小分子盐，浓缩后冻干干燥，可得到31.21mg纯化的桦褐孔菌多糖。多糖的提取率最高为2.20±0.02％，分子量为4.08×104(±6.08％)Da。实施例四桦褐孔菌多糖单糖比例由实施例三制备得到的桦褐孔菌多糖，经高效阴离子色谱法检测，其单糖组成为半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，四种单糖的摩尔浓度比为2：3.5：1：1.5。高效阴离子色谱法检测单糖组成的主要步骤如下：取2mg多糖样品放入薄壁长试管中，加入2mol/L三氟乙酸(TFA)4mL，在110℃下水解4h，减压蒸干(低于40℃)后，加入3mL甲醇再蒸干，重复以上步骤4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备桦褐孔菌多糖的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)桦褐孔菌子实体粉碎后用乙醇超声脱脂，过滤，滤渣挥干酒精后，沸水提取3次，合并滤液后，减压浓缩至料液比为1g：12mL的提取液；(2)提取液中加入硫酸铵溶解，然后加入0.5‑3倍体积的叔丁醇，恒温30℃反应15‑90min，离心分层；(3)将下层水相使用截留分子量为8000‑10000的透析袋流水透析，透析袋内溶液浓缩后干燥，可得到纯化的桦褐孔菌多糖。

【技术特征摘要】
1.一种制备桦褐孔菌多糖的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)桦褐孔菌子实体粉碎后用乙醇超声脱脂，过滤，滤渣挥干酒精后，沸水提取3次，合并滤液后，减压浓缩至料液比为1g：12mL的提取液；(2)提取液中加...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾薇，汪雯翰，张劲松，余冬生，张赫男，庄海宁，周帅，刘艳芳，杨焱，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31