一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法技术

本发明专利技术提供了一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法，属于生物技术育种领域，本发明专利技术包括1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜恢复系为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取授粉后9～15d的子房消毒；3)离体培养18～25d；4)剥离离体培养18～25d子房里的胚珠，诱导培养至萌发；5)分化培养，得F1代幼苗；6)分离F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上，得完整杂交苗。本发明专利技术利用胚挽救技术克服了结球甘蓝与甘蓝型油菜栽培种远缘杂交时容易发生幼胚败育而无法获得杂种植株的问题，将油菜的优良恢复基因转入结球甘蓝胞质雄性不育栽培种中，恢复甘蓝的育性，为甘蓝的种质资源的创新与应用提供技术依据。

A method for obtaining Distant Hybridization Progenies between cabbage and Brassica napus

The invention provides a method for obtaining the distant hybrid offspring of Brassica napus and Brassica napus, which belongs to the field of biological technology breeding. The invention includes 1) selecting the cytoplasmic male sterile line of cabbage, taking the Brassica napus as the parent, isolating after artificial pollination, and 2) cutting the ovary of 9 ~ 15d after pollination. 3) 3) in vitro culture 18 ~ 25d; 4) peeling off the ovules from 18 ~ 25d ovary in vitro, inducing culture and germination; 5) differentiation and culture, F1 generation seedlings; 6) separating the lateral buds from the seedlings of the F1 generation, inoculated on the rooting medium, and got the complete hybrid seedlings. The invention uses embryo rescue technology to overcome the problem that the embryo abortion is easy to occur in the distant hybridization of cabbage and Brassica napus, and the fine recovery gene of Brassica napus is transferred into the cytoplasmic male sterile plant of cabbage, and the fertility of cabbage is restored and the germplasm resources of cabbage are innovating. The application provides the technical basis.

【技术实现步骤摘要】
一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法
本专利技术属于生物技术育种领域，具体涉及一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法。
技术介绍
结球甘蓝(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.，2n＝18)简称甘蓝，属十字花科芸薹属甘蓝种，是我国重要的蔬菜作物，在全国各地均有栽培，年栽培面积达到9×105hm2左右。甘蓝的杂种优势比较明显。Ogura细胞质雄性不育系的材料表现为母体遗传、花粉败育和雌蕊正常，容易被恢复系材料的显性核恢复基因恢复育性，但无法进行正常的自交分离和进一步种质资源的创新。结球甘蓝和甘蓝型油菜都是十字花科中的重要栽培作物，该油菜材料又为恢复系材料，结球甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交，大大促进两种作物间的优异基因交流，将油菜的恢复系基因转到结球甘蓝雄性不育系材料上，恢复甘蓝的育性，为甘蓝的遗传育种与种质资源的创新奠定了基础。但两者由于受精后杂种胚、胚乳和子房之间缺乏协调性，导致幼胚不发育或中途停止发育，是远缘杂交育种工作的瓶颈。在十字花科蔬菜育种过程中胚挽救技术虽有一些报道。例如：Diederichsen采用远缘杂交结合胚挽救技术获得了西兰花与大白菜杂交的F1代，连续回交之后将A基因组CR基因转移到C基因组中；Snowdon等将抗黑胫病基因从白芥转移到了甘蓝型油菜；胡大为等以黑芥为母本、诸葛菜为父本的正交组合获得了1株真杂种；李俊等以白菜和芥蓝进行正反杂交，研究结果显示，白菜×芥蓝的平均杂种获得率(2.32％)；但到目前为止，国内外几乎没有利用幼胚挽救离体培养技术实现亲缘关系相对较远的十字花科结球甘蓝与甘蓝型油菜种间杂交并获得杂交后代植株的案例，而且培养周期长、技术复杂。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法，克服甘蓝与甘蓝型油菜栽培种远缘杂交时容易发生幼胚败育而无法获得杂种植株的问题，将油菜的优良恢复基因转入结球甘蓝胞质雄性不育栽培种中，恢复甘蓝的育性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取步骤1)所述人工授粉后9～15d的子房，消毒后得消毒子房；3)将步骤2)得到的所述消毒子房接种于子房诱导培养基上，子房诱导培养18～25d；所述子房诱导培养基以B5为基本培养基，还包括0.5～1.5mg/L的6-BA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；4)剥离步骤3)所述离体培养18～25d子房里胚珠接种于胚珠诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述胚珠诱导培养基以MS为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L的GA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；5)将步骤4)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得F1代幼苗；所述分化培养基以MS为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/L的6-BA、20～35g/L的蔗糖和6～10g/L的琼脂，pH值为5.5～6.0；6)分离步骤5)所述F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/L的NAA、20～35g/L的蔗糖和6～8g/L的琼脂，pH值为5.5～6.0。优选的，步骤1)所述母本为秦甘58或秦甘68，父本为RFO-46。优选的，步骤2)所述消毒，包括乙醇浸泡10～50s后升汞消毒10～30min。优选的，步骤3)所述子房诱导培养的条件包括：温度22～26℃，光照强度1100～2000lux，光照10～14h/d。优选的，步骤4)所述胚珠诱导培养的条件包括：温度22～26℃，光照强度1100～2000lux，光照10～14h/d。优选的，步骤5)所述分化培养的条件包括：26～30℃，光照强度1100～2000lux，光照10～14h/d。优选的，步骤6)所述生根培养的条件包括：25～27℃，光照强度1500～2000lux，光照10～12h/d。优选的，步骤6)得到所述完整杂交苗后，还包括炼苗、移栽。优选的，所述炼苗的方法包括将所述完整杂交苗置于室内自然光下培养1～4d。优选的，所述移栽的基质包括体积比为(4～8):1:(1～5)的泥炭、珍珠岩和蛭石。本专利技术提供了一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法，利用胚挽救的方式克服了结球甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交时由于染色体数目、结构不对等，受精后杂种胚、胚乳和子房之间缺乏协调性，导致幼胚不发育或中途停止发育无法获得杂一代植株的问题，同时甘蓝型油菜含有恢复系基因，将其转到结球甘蓝雄性不育材料上，恢复结球甘蓝的育性；选择授粉9～15d的幼胚培养，可大大提高出胚率，获得80％的杂种后代，获得杂交后代的周期为35d，相比于现有技术，大大缩短胚挽救诱导时间。附图说明图1为添加杂交授粉套袋隔离图；图2为子房诱导成愈伤组织图；图3为胚珠萌发后分化成苗图；图4为亲本与杂交种F1代植株叶型对比图，其中4-1-1、4-1-2为甘蓝型油菜，4-2-1、4-2-2为杂交种F1代，4-3-1、4-3-2为结球甘蓝；图5为亲本与杂交种F1代植株的流式细胞仪检测结果图，其中A为结球甘蓝，B为甘蓝型油菜，C为杂交种F1代；图6为亲本与杂种植物的SSR标记鉴定电泳图，其中M1、M2为DNAMarker，1～4为结球甘蓝，5～7为甘蓝型油菜，27～34为真杂交种F1代。具体实施方式本专利技术提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，包括以下步骤：1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取步骤1)所述人工授粉后9～15d的子房，消毒后得消毒子房；3)将步骤2)得到的所述消毒子房接种于子房诱导培养基上，子房诱导培养18～25d；所述子房诱导培养基以B5为基本培养基，还包括0.5～1.5mg/L的6-BA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；4)剥离步骤3)所述离体培养18～25d子房里的胚珠接种于胚珠诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述胚珠诱导培养基以MS为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L的GA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；5)将步骤4)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得F1代幼苗；所述分化培养基以MS为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/L的6-BA、20～35g/L的蔗糖和6～10g/L的琼脂，pH值为5.5～6.0；6)分离步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取步骤1)所述人工授粉后9～15d的子房，消毒后得消毒子房；3)将步骤2)得到的所述消毒子房接种于子房诱导培养基上，子房诱导培养18～25d；所述子房诱导培养基以B5为基本培养基，还包括0.5～1.5mg/L的6‑BA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；4)剥离步骤3)所述离体培养18～25d子房里的胚珠接种于胚珠诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述胚珠诱导培养基以MS为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L的GA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；5)将步骤4)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得F1代幼苗；所述分化培养基以MS为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/L的6‑BA、20～35g/L的蔗糖和6～10g/L的琼脂，pH值为5.5～6.0；6)分离步骤5)所述F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/L的NAA、20～35g/L的蔗糖和6～8g/L的琼脂，pH值为5.5～6.0。...

【技术特征摘要】
1.一种获得结球甘蓝与甘蓝型油菜远缘杂交后代的方法，包括以下步骤：1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取步骤1)所述人工授粉后9～15d的子房，消毒后得消毒子房；3)将步骤2)得到的所述消毒子房接种于子房诱导培养基上，子房诱导培养18～25d；所述子房诱导培养基以B5为基本培养基，还包括0.5～1.5mg/L的6-BA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；4)剥离步骤3)所述离体培养18～25d子房里的胚珠接种于胚珠诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述胚珠诱导培养基以MS为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L的GA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；5)将步骤4)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得F1代幼苗；所述分化培养基以MS为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/L的6-BA、20～35g/L的蔗糖和6～10g/L的琼脂，pH值为5.5～6.0；6)分离步骤5)所述F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以MS...

【专利技术属性】
技术研发人员：许忠民，张恩慧，王杏利，姜娇，李升娟，郭佳，马青山，石汶汶，吴晓凤，董艺，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61