一种PD-1纳米抗体及其克隆表达方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种PD‑1纳米抗体及其克隆表达方法与应用。该PD‑1纳米抗体分子量小、特异性强、亲和力高，能抑制PD‑L1与PD‑1分子之间的相互作用，并能特异识别细胞表面天然构象PD‑1，阻断PD‑L1与PD‑1结合从而保持T细胞活性；具有与PD‑1单克隆抗体(IgG全抗体)相同的结合能力；并能逆转活化T细胞被PD‑L1抑制的状态。同时，与PD‑1单克隆抗体相比，经过相同高温处理后本发明专利技术纳米抗体的相对活性更高，热稳定性更好，具有开发成为免疫检查点抑制剂的潜力。同时，本发明专利技术的纳米抗体克隆表达方法产量较高，获得蛋白纯度可达93％以上，制备方法简单，成本低廉，在制备抗肿瘤药物中具有良好的应用前景。

A PD-1 nano antibody and its cloning, expression and Application

The invention discloses a PD 1 nano antibody and its cloning expression method and application. The PD 1 nanoscale antibody has small molecular weight, strong specificity and high affinity. It can inhibit the interaction between PD L1 and PD molecules, and can specifically identify the natural conformation PD 1 of the cell surface, block the combination of PD L1 and PD 1 to maintain the T cell activity, and have the same binding ability as PD 1 monoclonal anti body (IgG total antibody). It can reverse the state that the activated T cells are inhibited by PD L1. At the same time, compared with the PD 1 monoclonal antibody, after the same high temperature treatment, the nano antibody has higher relative activity, better thermal stability, and has the potential to develop into an immunoassay point inhibitor. At the same time, the production of nano antibody cloning and expression of the invention is high, the purity of the obtained protein is above 93%, the preparation method is simple, the cost is low, and it has a good application prospect in the preparation of antitumor drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种PD-1纳米抗体及其克隆表达方法与应用
本专利技术属于生物医药
，特别涉及一种PD-1纳米抗体及其克隆表达方法与应用。
技术介绍
肿瘤是全球致死率最高疾病之一，严重威胁人类健康；除手术、放射治疗外，肿瘤的治疗方法还包括：化学疗法、激素疗法、靶向药物疗法和肿瘤免疫疗法。自2013年《科学》杂志将肿瘤免疫疗法列为年度最重要科学突破后，近年来肿瘤免疫疗法愈发备受关注。靶向阻断免疫检查点肿瘤免疫疗法逐渐成为了肿瘤治疗的关注热点，自2014年，FDA先后批准默沙东的Keytruda和百时美施贵宝的Opdivo用于治疗黑色素瘤以来，靶向程序性死亡分子1(programmeddeath-1，PD-1，CD279)的抗体在临床上展示了优异、广谱的抗肿瘤活性，使得PD-1抑制剂成为目前肿瘤免疫治疗中最具前景的治疗药物。T细胞被激活后诱导PD-1表达，与其配体PD-L1(programmedcelldeath1ligand1)或PD-L2(programmedcelldeath1ligand2，PD-L2)结合后，ITSM区的酪氨酸发生磷酸化，蛋白酪氨酸磷酸酶分子被招募，使得下游的效应分子去磷酸化，激活PD-1/PD-Ls信号通路，转导负调节信号，抑制T细胞活化，下调免疫反应。正常情况下，该信号通路在维持T细胞稳态方面起关键性作用。但在肿瘤微环境中，肿瘤侵润淋巴细胞、肿瘤特异性T细胞及一些损伤相关的T细胞表面高表达PD-1分子，肿瘤表面PD-L1与T细胞表面PD-1结合后，传递抑制性信号，使T细胞活性下调，从而抑制机体对肿瘤的免疫反应，导致肿瘤产生免疫逃逸。由于PD-1、PD-L1广泛地参与到肿瘤免疫逃逸，因此，靶向并阻断PD-1/PD-Ls通路可释放T淋巴细胞杀伤肿瘤的活性，从而有效抑制肿瘤进展。目前上市或获批临床试验的PD-1抗体均是单克隆抗体(monoclonalanbibody,mAb)(图1)，单克隆IgG全抗体具有组织渗透性弱、免疫原性较强、成本高等先天不足，此外，靶向PD-1的全抗体半衰期长，有引起机体过度免疫的潜在风险。1993年，HamersCasterman等从骆驼血清中分离出天然缺失轻链、仅含有重链的骆驼抗体，命名为重链抗体(heavy-chainantibody,HCAb)。而VHH(variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody)是重链抗体上能特异性结合抗原的结构域，是通过基因工程技术克隆重链抗体的可变区，得到只由一个重链可变区组成的单域抗体。因为VHH晶体直径2.5nm，长4nm，所以VHH也被称为纳米抗体(Nanobody，Nb)。纳米抗体具有高亲和力、高稳定性、高水溶性、高抗原结合性、高表达、强组织渗透性、低免疫原性以及半衰期短的特点，在治疗性抗体药物开发领域具有独特优势，目前尚未有具功能活性的PD-1纳米抗体药物的报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新的抗PD-1抗体(纳米抗体)。本专利技术的另一目的在于提供所述的PD-1纳米抗体的克隆表达方法。本专利技术的又一目的在于提供所述的PD-1纳米抗体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种程序性死亡分子1的纳米抗体(PD-1纳米抗体)，包含由框架区FR(frameworkregion)和互补决定区CDR(complementarity-determiningregions)组成的可变区结构域，所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的CDR1，(2)SEQIDNo.3所示的CDR2，(3)SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的CDR3。所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQIDNo.1所示的CDR1，SEQIDNo.3所示的CDR2和SEQIDNo.4所示的CDR3；(2)SEQIDNo.2所示的CDR1，SEQIDNo.3所示的CDR2和SEQIDNo.5所示的CDR3。所述的框架区FR选自下组的FR1、FR2、FR3和FR4：(1)SEQIDNo.6所示的FR1；(2)SEQIDNo.7或SEQIDNo.8所示的FR2；(3)SEQIDNo.9所示的FR3；(4)SEQIDNo.10所示的FR4。所述的PD-1纳米抗体的氨基酸序列选自如下任一序列所示：QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVASGFTHLRYSMGWFRQVLDKEREGVAAIGGDGRTSYADSVKGRFTIFKDNAKNTLYLDMNSLNPEDTAMYYCAAAVLLDGSFSLLAPLVPYKYDYWGQGTQVTVSS(SEQIDNo.11)或QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVASGLTYLRYSMGWFRQVPDKEREGVAAIGGDGRTSYADSVKGRFTIFKDNAKNTLYLDMNSLNPEDTAMYYCAAAVLLDGSFSLLAPLTPYKYDYWGQGTQVTVSS(SEQIDNo.12)；上述的氨基酸序列左侧开始为氨基端，右侧结束为羧基端，其顺序为：无下划线的序列分别是框架区：FR1～FR4；有下划线的是互补决定区，CDR1～CDR3。所述的PD-1纳米抗体包含与SEQIDNo.11或SEQIDNo.12所示的任一氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列。如SEQIDNo.11或SEQIDNo.12所示的任一氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸的氨基酸序列。所述的取代优选为与SEQIDNo.11或SEQIDNo.12所示的任一氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。编码所述的PD-1纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列，选自如下的(1)、(2)或(3)：(1)如SEQIDNo.13或SEQIDNo.14所示的核苷酸序列；(2)与SEQIDNo.13或SEQIDNo.14所示的核苷酸序列不同，但是编码如SEQIDNo.11或SEQIDNo.12所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(3)与(1)或(2)任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。所述的PD-1纳米抗体，具有下述特征中的至少一个：(1)阻断PD-1和PD-L1结合；(2)逆转PD-L1引起的T细胞失活状态；(3)抑制肿瘤生长。一种核酸分子，编码所述的PD-1纳米抗体。一种重组表达载体，含有编码所述的PD-1纳米抗体氨基酸序列的核苷酸序列的重组表达载体。所述的表达载体为噬菌粒载体或者能编码所述PD-1纳米抗体氨基酸序列的其他细菌表达载体，以及酵母表达载体、真核细胞表达载体。所述的噬菌粒载体优选为噬菌粒pMECS。一种宿主细胞，其转化了所述的重组表达载体或者基因组上整合了所述的编码所述的PD-1纳米抗体的核苷酸序列的宿主细胞及其后代细胞。所述的宿主细胞及其后代细胞指细菌细胞、真菌细胞、动物细胞或者植物细胞及这些宿主细胞的后代。所述的宿主细胞优选为大肠杆菌；进一步优选为E.coliWK6。所述的PD-1纳米抗体的克隆表达方法，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PD‑1纳米抗体，包含由框架区FR和互补决定区CDR组成的可变区结构域，其特征在于，所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的CDR1；(2)SEQ ID No.3所示的CDR2；(3)SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.一种PD-1纳米抗体，包含由框架区FR和互补决定区CDR组成的可变区结构域，其特征在于，所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的CDR1；(2)SEQIDNo.3所示的CDR2；(3)SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的CDR3。2.根据权利要求1所述的PD-1纳米抗体，其特征在于，所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(1)SEQIDNo.1所示的CDR1，SEQIDNo.3所示的CDR2和SEQIDNo.4所示的CDR3；(2)SEQIDNo.2所示的CDR1，SEQIDNo.3所示的CDR2和SEQIDNo.5所示的CDR3。3.根据权利要求1所述的PD-1纳米抗体，其特征在于，所述的框架区FR选自以下的FR1、FR2、FR3和FR4：(1)SEQIDNo.6所示的FR1；(2)SEQIDNo.7或SEQIDNo.8所示的FR2；(3)SEQIDNo.9所示的FR3；(4)SEQIDNo.10所示的FR4。4.根据权利要求1所述的PD-1纳米抗体，其特征在于：所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊盛，邓颖莎，陈纯，谢秋玲，卢加，李军，洪岸，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44