多价抗体片段与其三聚复合物制造技术

本发明专利技术涉及产生多价Fab片段的方法。特别是，本发明专利技术涉及藉由在一哺乳动物细胞中共表达包含一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一基因构筑体以及由IgG的一轻链部分所组成的一基因构筑体的三聚体Fab片段的产生的方法。使用本发明专利技术方法所产生的分子的用途也被描述。

Polyvalent antibody fragment and its trimer complex

The present invention relates to a method of producing multivalent Fab fragments. In particular, the present invention relates to a method for the production of a gene structure consisting of a heavy chain part containing a Fab fragment in a mammalian cell and a gene structure of a collagen like peptide fused in a frame and a trimer Fab fragment of a gene architecture composed of a light chain part of the IgG. The use of molecules produced by the method of the invention is also described.

【技术实现步骤摘要】
多价抗体片段与其三聚复合物
本专利技术涉及产生多价Fab片段的方法。特别是，本专利技术涉及藉由在一哺乳动物细胞中共表达包含一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一基因构筑体以及由IgG的一轻链部分所组成的一基因构筑体的三聚体Fab片段的产生的方法。
技术介绍
功能性亲和(力)(functionalaffinity(avidity))为一抗原与许多抗原决定因素(antigenicdeterminants)的整体结合能力的程度。对于结合至非常接近一目标细胞的一群组的特异相同配体而言，抗原结合伙伴的聚合大幅增加它们的效用(或价数(valency))，引起更大的目标结合效力、减缓的分离率与可延长配体的调节与促进生物潜力的交联作用。一单链变异片段(single-chainvariablefragment,scFv)为免疫球蛋白的重链(VH)与轻链(VL)的变异区的一融合蛋白，藉由一短的连结胜肽来连结。与双价免疫球蛋白G(IgG)对应物(counterpart)相较，scFv的主要缺点为产物的单价，其妨碍由于多价结合增加的亲和力。为了增加亲和力，已针对scFv的多聚化发展了许多策略。藉由使用三聚体化区域的三价单链抗体片段(scFv)融合蛋白的重组产生已被报导，三价单链抗体片段(scFv)融合蛋白包括一型前胶原蛋白(procollagen)的C前胜肽(C-propeptide)、胶原凝集素(collectin)家族蛋白质的一卷曲螺旋颈域(coiled-coilneckdomain)、FasL的一C端部分与一噬菌体(bacteriophage)T4弹力素(fibritin)折叠区(Hoppe,H.J.,P.N.Barlow,etal.(1994)."Aparallelthreestrandedalpha-helicalbundleatthenucleationsiteofcollagentriple-helixformation."FEBSLett344(2-3):191-195;Frank,Kammereretal.2001"Stabilizationofshortcollagen-liketriplehelicesbyproteinengineering."JMolBiol308(5):1081-1089;Holler,N.,A.Tardivel,etal.(2003)."TwoadjacenttrimericFasligandsarerequiredforFassignalingandformationofadeath-inducingsignalingcomplex."MolCellBiol23(4):1428-1440.)。具有自身三聚体化与来自C-或N-端方向的异源融合蛋白质的增殖能力的短α螺旋类胶原蛋白胜肽也已在EP1798240B1中被报导。于EP1798240B1中使用的异源融合区被呈现于scFv抗体片段中。然而，在治疗应用的多价形式中，scFv具有缺点。不像免疫球白G(IgG)分子，其可藉由使用蛋白质A或G结合的树脂亲和层析(affinitychromatographies)，经由与IgG的Fc片段结合而容易地被纯化，于纯化方案的第一步骤，产生于大于98%产物同构型，用于治疗应用的多聚scFV融合体的纯化为挑战的工作，由于并无可获得的市售亲和柱。多价的scFv依据建构它们的特异变异区具有明显差异的稳定度(Jung,S.,A.Honegger,etal.(1999)."Selectionforimprovedproteinstabilitybyphagedisplay."JMolBiol294(1):163-180;Worn,A.andA.Pluckthun(2001)."Stabilityengineeringofantibody单链Fvfragments."J.MolBiol305(5):989-1010)。已报导经由变异区交换来媒介嵌合抗CD20单链Fv-Fc融合蛋白的多聚体化，导致异源抗体变异体(Wu,A.M.,G.J.Tan,etal.(2001)."Multimerizationofachimericanti-CD20singlechainFv-Fcfusionproteinismediatedthroughvariabledomainexchange."ProteinEng14(12):1025-1033)。CFY196由与源自人类免疫球蛋白D枢纽的一联结子融合的人源化变体的mAb1A616的一Fab片段以及源自人类转录因子ATFα的卷曲螺旋序列的四聚体化区域所组成(Charles,Luoetal.2003)。然而，ATFα并非一原生质取得的蛋白质(plasma-derivedprotein)，其可能与一可严重限制潜在治疗应用的免疫反应的风险相关。美国专利申请公开U.S.2008/0176247显示与包括GPP三连体(triplets)的一自身三聚体化类胶原蛋白支架N端融合的一抗-CD3scFv具有形成由三个单链胜肽构成的三聚体抗体片段的能力。然而，这些类胶原蛋白支架融合体的三聚体scFv变体的下游纯化是麻烦的，因为并无可获得的亲和树脂来有效地将其纯化。此外，所述三聚体scFv变体的低蛋白质表现程度与热不稳定性不具备用于生物治疗的条件。因此，需要设计一新形式的三聚体胶原蛋白支架抗体。
技术实现思路
本实施例包括一种在一真核细胞中产生一多价Fab片段的方法，包括在一真核细胞中共表达之步骤：(1)一编码出包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列的基因构筑体；以及(2)一编码出包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列的基因构筑体。在一实施例中该(1)基因构筑体更包括编码出一来自人类IgG的枢纽区的一序列。在一实施例中，该人类IgG系选自IgG1、IgG2、IgG3与IgG4所组成的群组。在一实施例中，编码出该枢纽区的该序列在该基因构筑体中座落于该Fab片段与该类胶原蛋白胜肽之间。在一实施例中，该(1)的基因构筑体更包括编码出一单链Fv的一序列。在一实施例中，该(2)的基因构筑体包括一人类IgG1的kappa轻链。本专利技术的实施例包括藉由上方所讨论的方法来产生的多价Fab片段。另一实施例包括三聚的多价Fab片段，包括藉由至少它们的类胶原蛋白区来结合在一起的三个多价Fab片段。一另外实施例包括一种多价抗体片段，包括：(1)包括一Fab片段的一重链部分与一框架内融合的类胶原蛋白胜肽的一胺基酸序列；以及(2)包括人类IgG的一轻链变异区与kappa轻链固定区的一胺基酸序列。在一实施例中，该抗体片段为双特异性。上方讨论的实施例的多价抗体片段的配体，可为人类CD3或人类CD3与人类表皮生长因子受体。另一实施例为编码该蛋白质实施例的一核酸、表现该蛋白质实施例的表达载体或包括该表达载体和/或该核酸的宿主细胞。本专利技术提供藉由使用抗-CD3抗体片段来治疗、避免或改善T细胞居中心地位的免疫疾病的症状的方法，特别是自体免疫疾病。特别是，本专利技术的方法为了与人类CD3复合物内的epsilon次单元特异结合的抗体的投予作准备。此类抗体调节T细胞受体/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产生抗体片段三聚体的方法，包括在宿主细胞中共表达的步骤：(1)第一核酸，编码出氨基酸序列，其从N端至C端包括，信号肽(signal peptide)、OKT3重链可变区(heavy chain variable region)、人类IgG的CH1区、铰链区(hinge region)与类胶原蛋白多肽(collagen‑like peptide)，其中所述铰链区由序列号(SEQ ID NO:)：18或19所组成；以及(2)第二核酸，编码出氨基酸序列，其从N端至C端包括，信号肽、OKT3轻链可变区(light chain variable region)与人类IgG的kappa轻链恒定区(light chain constant region)。

【技术特征摘要】
2012.12.26 TW 101150029;2013.10.09 TW 102136456;201.产生抗体片段三聚体的方法，包括在宿主细胞中共表达的步骤：(1)第一核酸，编码出氨基酸序列，其从N端至C端包括，信号肽(signalpeptide)、OKT3重链可变区(heavychainvariableregion)、人类IgG的CH1区、铰链区(hingeregion)与类胶原蛋白多肽(collagen-likepeptide)，其中所述铰链区由序列号(SEQIDNO:)：18或19所组成；以及(2)第二核酸，编码出氨基酸序列，其从N端至C端包括，信号肽、OKT3轻链可变区(lightchainvariableregion)与人类IgG的kappa轻链恒定区(lightchainconstantregion)。2.权利要求1所述的方法，其中具有所述CH1区与具有所述kappa轻链恒定区的所述人类IgG选自IgG1、IgG2、IgG3与IgG4所组成的群组。3.权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸更包括编码出单链Fv的序列。4.抗体片段三聚体，藉由权利要求1所述的方法来产生。5.抗体片段三聚体，所述抗体片段三聚体为多价的，其包括三个抗体片段，所述三个抗体片段藉由至少它们的类胶原蛋白区来结合在一起，所述每一抗体片段包括：(1)从N端至C端包括信号肽、OKT3重链可变区、人类IgG的CH1区、铰链区与类胶原蛋白多肽的氨基酸序列，其中所述铰链区由序列号：18或19所组成；以及(2)从N端至C端包括信号肽、OKT3轻链可变区与人类IgG的kappa轻链恒定区的氨基酸序列。6.权利要求5所述的抗体片段三聚体，其中具有所述CH1区与具有所述kappa轻链恒定区的所述人类IgG选自IgG1、IgG2、IgG3与IgG4所组成的群组。7.权利要求5所述的抗体片段三聚体，其中所述(1)的氨基酸序列更包括单链Fv的序列。8.权利要求7所述的抗体片段三聚体，其中所述抗体片段为双特异性。9.权利要求5所述的抗体片段三聚体，其中所述多价抗体片段的配体为人类CD3...

【专利技术属性】
技术研发人员：周民元，黄娟娟，李秀娟，赖雅萍，
申请(专利权)人：财团法人工业技术研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71