一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法技术

本发明专利技术提供一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，是提取待检测的青蟹样品的核酸样品，然后用PCR引物对扩增核酸样品进行基因分型；其中拟穴青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1：锯缘青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术所建立的方法能够有效的鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹，其通过高分辨率熔融曲线HRM对待检测的青蟹进行分型，从而快速、准确鉴别青蟹种质，为青蟹的育苗养殖提供技术支持。

A method for identification of Scylla acupoint and Scylla serrata

The present invention provides a method for identifying the acupoint green crab and the serrate green crab. It is a nucleic acid sample of the sample of the green crab, and then the DNA sample is genotyping with PCR primers. The sequence of the corresponding nucleotide fragments in the acupoint crab is SEQ ID NO:1: the corresponding nucleotide fragment in the serrated crab crab. The sequence is SEQ ID NO:2. The method established in the present invention can effectively identify the acupoint green crab and the serrated crab, which can be classified by the high resolution melting curve HRM for the detection of green crab, which can quickly and accurately identify the germplasm of green crab, and provide technical support for the breeding of green crab.

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法
本专利技术属于分子标记辅助遗传育种
，具体涉及一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法。
技术介绍
青蟹属(Scylla)隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapode)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)。广泛分布于印度一西太平洋沿岸水域，包括东南亚、澳大利亚、日本、印度、南非等海域的红树林地区及河口内湾区，在我国主要分布于浙江、福建、台湾、广东、广西和海南沿岸水域。青蟹具有个体大、生长快、适应性强、肉味鲜美、营养丰富等特点，已成为世界性的经济养殖品种，但是随着捕捞强度的加大，海洋环境的污染，野生青蟹资源严重衰退，根据陈丕茂等人在2002-2004年各礁区拖网调查,蟹类资源密度为180.985kg·km-2,但经济蟹类所占比例仅为26.69％，且在以往调查中出现率较高且经济价值较高的锯缘青蟹未捕到，因此青蟹的人工养殖迫在眉睫。拟穴青蟹和锯缘青蟹是我们国家常见青蟹种类，由于不同青蟹在养殖生态学、繁殖学、营养学等生理生态方面有较大差异，不同种青蟹育苗要求不同，开展青蟹属种类的鉴定研究有助于青蟹养殖技术的发展。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，以及该方法所使用的分子标记；通过本专利技术的方法能够有效的鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的用于鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，是提取待检测的青蟹样品的核酸样品，然后用PCR引物对扩增核酸样品进行基因分型；其中拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)中对应的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:1：AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCTATTTAACA-TTTTTGTCAGTGAGCAGGCTAGACTATA；锯缘青蟹(Scylla_serrata)中对应的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:2：AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCTATTTAACACTTTTTGTCAGTGAGCAGGCTAGACTATA；其中所使用的引物对，能够同时扩增上述核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的基因片段；作为实施例的一种具体记载，所述的引物对的上游引物的序列如下：5′-AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACC-3′(SEQIDNO:3)下游引物的序列如下：5′-TATAGTCTAGCCTGCTCACTGACA-3′(SEQIDNO:4)；上述的基因分析是使用高分辨率熔解曲线方法，其中反应程序如下：95℃预变性10min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃30s，45个循环。本专利技术所建立的方法能够有效的鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹，其通过高分辨率熔融曲线HRM对待检测的青蟹进行分型，从而快速、准确鉴别青蟹种质，为青蟹的育苗养殖提供技术支持。附图说明图1：拟穴青蟹和锯缘青蟹的外部形态图；图2：SNP分子标记的拟穴青蟹和锯缘青蟹序列比对图；图3：引物HRM扩增的标准化基准位移图；图4：引物HRM扩增的熔解曲线峰图；图5：鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的HRM图。具体实施方式传统上对于拟穴青蟹和锯缘青蟹都是通过形态学来进行鉴定，例如通过头胸甲螯足的外在形态特征来区别。例如拟穴青蟹头胸甲光滑,无小突起及白斑，螯及步足网格状斑纹较少，色较很淡。颜色因环境不同呈黄绿色或橄榄绿色；螯足腕节外缘内刺完全退化，微微凸起至接近光滑。而锯缘青蟹甲壳背面有白色斑点,螃蟹呈深绿色或绿褐色；螯及所有步足具明显的网状斑纹，颜色较深；螯足腕节外缘内、外刺较为尖锐(图1)。但上述的形态特征会在养殖或捕捞、运输的过程中造成损伤，导致通过形态特征无法进行鉴定。因此研究和保护青蟹种质的研究和鉴定技术，对我国青蟹产业可持续发展有着重要作用。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指单个核苷酸的变异导致的DNA序列多态性。SNP在动植物基因组中数量多，分布广，遗传稳定，通常是二等位性(个别位点有三等位、四等位)，故易于进行自动化分析。作为第3代分子标记的代表，SNP标记被广泛用于遗传图谱构建、性状关联分析、种群/个体鉴定、分子标记辅助育种等研究中。但通过SNP进行种群/个体鉴定的一个关键问题是发现相关的SNP位点，本专利技术正是在筛选获得了能够区别拟穴青蟹和锯缘青蟹的SNP位点后建立起来的。所使用的高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的分子标记的筛选在NCBI数据库中获得拟穴青蟹、锯缘青蟹的mtDNA序列，使用AlignX(acomponentofVectorNTISuite7.1)软件进行序列比对，找出青蟹中的差异碱基区域；最终筛选得到的consensus序列，在consensus序列的13274-13362区间，以consensus序列为基准，设计引物，pcr扩增并测序验证，计数SNP出现位置为13334，共1个SNP位点。包含上述SNP位点的拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)中对应的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:1：AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCTATTTAACA-TTTTTGTCAGTGAGCAGGCTAGACTATA；锯缘青蟹(Scylla_serrata)中对应的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:2：AATTAAAAAACTAATGATTATGCTACCTTTGCACGGTCAAAATACCGCGGCTATTTAACACTTTTTGTCAGTGAGCAGGCTAGACTATA；其序列的差异的序列比对如图2所示，包含该SNP位点的基因片段可以有效的将青蟹属的拟穴青蟹和锯缘青蟹进行区分。从上述的片段设计能够扩增拟穴青蟹和锯缘青蟹片段的通用引物，引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在50-150bp之间；为使熔解温度不同，序列之间存在GC碱基含量的差异；退火温度(Tm)应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体；引物由华大基因工程有限责任公司合成。随机选择5个所对应的青蟹DNA样本作为模板，使用琼脂糖凝胶电泳技术对引物进行初步筛选，选择能扩增出明亮、单一条带的引物组合进行HRM分析。最终确定的引物序列如下：表1：HRM分析用的引物对信息使用上述的引物进，使用480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL1×480HRMMasterMixwithdye(RocheDiagnostics)，正反引物各10μmol，100ngDNA模板，1.6μLMgcl2，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在480实时定量分析仪(RocheDiagnostics)上进行。反应程序如下：95本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，其特征在于，所述的方法是提取待检测的青蟹样品的核酸样品，然后用PCR引物对扩增核酸样品进行基因分型；其中拟穴青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1：锯缘青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别拟穴青蟹和锯缘青蟹的方法，其特征在于，所述的方法是提取待检测的青蟹样品的核酸样品，然后用PCR引物对扩增核酸样品进行基因分型；其中拟穴青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:1：锯缘青蟹中对应的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:2。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的引物对能够同时扩增核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的基因片段。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:3；下游引物的序列为SEQIDNO:4。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈夏月，李荣华，王春琳，母昌考，宋微微，叶央芳，刘磊，史策，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33