一种蚕豆根瘤菌株系Blgs19‑2及其应用，该菌株是从新鲜的蚕豆根瘤中分离纯化得到的，属于根瘤菌属Rhizobium anhuiense株系。该菌株系于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2017614。本发明专利技术的根瘤菌株系Blgs19‑2是一种共生固氮能力强、对四川蚕豆品种适应范围广，兼具有分泌IAA、溶无机磷和有机磷能力、抗逆性强的优良广谱蚕豆根瘤菌菌株；与四川的主栽蚕豆品种匹配亲和性好，在四川不同品种的蚕豆生产中，不施氮肥、接种Blgs19‑2使蚕豆增产37.8％以上，与不接种对照的差异达显著水平。
A strain of Vicia faba root nodule strain Blgs19-2 and its application
A strain of Vicia faba root nodule strain Blgs19 2 and its application were isolated and purified from the fresh root nodules of broad bean, and belong to the Rhizobium anhuiense strain of the genus rhizobia. The strain was preserved in the typical Chinese Culture Preservation Center of Wuhan University in October 23, 2017. Its preservation number is CCTCC NO:M2017614. The Rhizobium strain Blgs19 2 of the present invention is an excellent broad-spectrum broad bean Rhizobium with strong capacity of symbiotic nitrogen fixation, wide adaptation to Sichuan broad bean variety, and a good broad-broad-broad-broad-bean Rhizobium strain that secretes IAA, dissolved inorganic phosphorus and organophosphorus, and strong resistance to adversity. It is well matched with the main variety of broad bean varieties in Sichuan and is born in different varieties of broad bean in Sichuan. The yield of faba bean increased by more than 37.8% without nitrogen fertilizer and inoculated with Blgs19 2.
【技术实现步骤摘要】
一种蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2及其应用
本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一种蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2及其应用。
技术介绍
中国是最大的蚕豆生产国，干蚕豆产量占世界35％(FAO2014)，是我国传统对外贸易的重要农产品资源，出口量在全国杂粮中居第二(刘玉皎等，2002)。四川省蚕豆播种面积约30万公顷，仅次于云南，总产达6亿公斤(杨武云，2003)。以蚕豆为原材料的四川郫县豆瓣全国闻名，需求量大，每年所需蚕豆达12万吨，但现在主要靠从外地进口。除了收获干蚕豆，也可以收鲜蚕豆作为经济价值较高的蔬菜，还可以用作绿肥，因此在四川种植蚕豆具有很大潜力，但是，近年来由于氮素肥料的大量投入使用，导致生产面积逐年下降，产量也较西方国家有所下降，并且氮素肥料生产成本高、利用率低，同时污染生态环境，不利于生态环境的保护和农业的可持续发展。豆科作物接种匹配高效的根瘤菌是国际上公认的一种有效的生物固氮技术，生物固氮优质，利用率高，释放氮素过程持续，后效长，浪费少，对环境无污染(葛诚，2007)，有利于生态环境的保护和农业的可持续发展，前人研究认为，蚕豆—根瘤菌这一共生体系固定氮素量大，其生长所需80％的氮素均来自于根瘤菌固氮，一个生长季节能够固定并提供约200KgN/ha，远远高于大豆(100KgN/ha)(Hardarsonetal，2003)。韩梅等(2016)在青海省接种根瘤菌可以显著地提高蚕豆的产量，增加土壤肥力；王文丽等(2010)在甘肃省的蚕豆生产中接种根瘤菌以后较不接种处理生物量增加了6.48％～12.86％。面对化肥零增长及减施增效的重大科技需求，蚕豆的生产是可以用匹配的高效根瘤菌来实现优质高产的。由于根瘤菌的群体分布具有地理局限性，需要注意其对应用地区环境的适应能力(陈文新等，2004)。一般来说，在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株(崔雅琪，2014；陈文新等，2011)。因此，在根瘤菌高效固氮菌株的筛选中，不仅要考虑根瘤菌与豆科植物品种的匹配性，还必须重视菌剂应用的地域性。现有研究表明，极少数根瘤菌还具有溶磷、分泌生长激素(IAA)等促生特性。师尚礼(2007)等对730余株苜蓿根瘤菌进行研究，仅从这29株根瘤菌筛选到10株分泌IAA能力强的根瘤菌，对这29株菌进行溶磷能力的测定，发现全部菌株没有溶解无机磷的能力，这29个苜蓿根瘤菌都能够溶解有机磷，但溶磷能力差异较大，仅8个菌株有较强的溶解有机磷的能力，其余菌株有弱或微弱的溶有机磷的能力。目前有关蚕豆高效根瘤菌的筛选应用，除了青海、甘肃地区(刁治民，2002；韩梅等，2010；王文丽等，2010)、及河北地区(王瑞，2016)有相关性报道外，还未见其他报道。为此，针对四川的主栽品种进行蚕豆广谱优良菌株的筛选，对四川蚕豆生产中充分发挥生物固氮作用，筛选优良菌株资源，减少化肥施用或不施氮肥，同时对于保护生态环境，推动农业可持续发展具有重要实践价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种高效固氮的蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2，具有分泌IAA、一定溶磷能力，并有较好的田间生产应用前景。本专利技术采取的技术方案：一种蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2，其分类命名为RhizobiumanhuienseBlgs19-2，于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2017614。所述蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2应用于四川蚕豆主产区成都平原地区蚕豆的生产。本专利技术的有益效果：本专利技术的根瘤菌株系Blgs19-2是一种共生固氮能力强、对四川蚕豆品种适应范围广，兼具有分泌IAA、溶无机磷和有机磷能力、抗逆性强的优良广谱蚕豆根瘤菌菌株；与四川的主栽蚕豆品种匹配亲和性好，在四川不同品种的蚕豆生产中，不施氮肥、接种Blgs19-2使蚕豆增产37.8％以上，与不接种对照的差异达显著水平。附图说明图1为蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2在YMA培养基上的菌落形态；图2为蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2的16SrRNA基因序列的系统发育图；图3为蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2的glnII、atpD、recA三个持家基因联合构建的系统发育图。具体实施方式实施例1根瘤菌的分离、纯化和保存从四川省凉山州宁南县潮土上种植的蚕豆中，选择健壮植株主根上大且饱满红色的根瘤，将根瘤擦洗干净，带部分根皮采下，用纸吸干并将其放在装有无水氯化钙并覆有脱脂棉的小管中。在实验室将采集的根瘤用无菌水浸泡吸胀后，用95％的乙醇处理5min，接着用0.1％m/v的升汞表面灭菌5min，再用无菌水冲洗6次，在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在加有刚果红的YMA培养基(甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH2PO40.25g，MgSO4.7H2O0.2g，CaCl2.6H2O0.1g，NaCl0.1g，钼酸钠(1％)2ml，硼酸(1％)2ml，刚果红(1％)2.5ml，琼脂18～20g，水1000ml，pH6.8-7.0)上划线，在28℃的恒温箱中培养。待长出菌落后，从平板上挑选不吸红、形态上像根瘤菌的菌落在平板上稀释划线培养。3d左右观察菌落形态，一直观察到15d左右，因慢生根瘤菌需7～15d出现菌落。重复稀释划线反复分离，直到纯化为止。根据以下两方面进行初步判定是否为根瘤菌：(1)加刚果红的YMA培养基上的菌落形态：不吸红，菌落圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较粘稠、较湿润。培养3-5d就长出菌落的为快生根瘤菌，培养5-10长出菌落的为慢生根瘤菌。(2)细胞形态：对确认的根瘤菌菌落作标记，制片进行革兰氏染色，根瘤菌的镜检结果为细胞呈小杆状且形态一致，无芽孢，细胞内常含β-羟基丁酸而呈环节状，革兰氏阴性(G-)。如果上述标记菌落具有上述两方面特征，则将该菌落接入YMA培养基的试管斜面培养保存。本实施例分离纯化得到的菌株Blgs19-2为快生根瘤菌，在加刚果红的YMA培养基上培养，菌体不吸红，菌落较小、圆形、乳白色、粘稠、隆起度较高、稍透明，3～4d长出菌落。经革兰氏染色镜检为G-，呈小杆状。实施例2根瘤菌的回接及匹配性试验根瘤菌的回接试验用的蚕豆品种是“大白蚕豆”，在光照室(控温22～24℃，光照强度2700～3000勒克斯，日照时间14hr)进行，种植46d收获。与“大白蚕豆”回接成功后再与其他的主栽蚕豆品种(“成胡14”，“成胡15”)进行匹配亲和性试验，也用水培法进行。在上述光照室培养41d收获。定期补充无菌无氮营养液。将快生蚕豆根瘤菌Blgs19-2与上述蚕豆品种形成不同组合，水培器采用250ml的细颈瓶(医院用的玻璃输液瓶)，以不接种所述蚕豆根瘤菌的同品种植株为对照。收获后用蚕豆植株的根瘤数及植株干重来评价蚕豆根瘤菌Blgs19-2的接种效果。回接试验与匹配性试验的菌液培养、种子的催芽、水培器的制作及种植方法一致。(1)菌液培养：将上述蚕豆根瘤菌Blgs19-2接种于YMA液体培养基中，放置摇床上用120rpm/min转速，28℃培养至对数生长期(约3～4d)。(2)种子的催芽：选择粒大、饱满的无损伤的蚕豆种子，用95％酒精浸5min，倒去酒精，加入0.1％的升汞溶液表面灭菌5min，最本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种蚕豆根瘤菌株系Blgs19‑2，其特征在于：于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017614。
【技术特征摘要】
1.一种蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2，其特征在于：于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2017614。2.根据权利要求1所述的蚕豆根瘤菌株系Blgs19-2的应用，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈远学，徐开未，全紫曼，胡月秋，解晋，周元，刘志恒，张渝蕊，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51
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