一种诱导肌腱组织再生的生物活性支架及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种制备诱导肌腱组织再生的生物活性支架的方法，包括如下步骤：(1)取新鲜肌腱，脱细胞处理，得脱细胞肌腱压片或切片支架；(2)在支架上复合细胞外基质，即可。本发明专利技术还公开了前述方法制备的脱细胞肌腱生物活性支架及其用途。本发明专利技术方法制备的脱细胞肌腱支架生物活性高，体内修复效果良好，免疫原性低，生物相容性好，制备方法简单，成本低廉，具有较好的应用前景。

Bioactive scaffold for inducing tendon tissue regeneration and preparation method and use thereof

The present invention discloses a method for preparing bioactive scaffold for inducing tendon tissue regeneration, including the following steps: (1) taking fresh tendons, depressing cell processing, removing cell tendon compression or slicing scaffolds, and (2) compound extracellular matrix on the scaffold. The invention also discloses a acellular tendon bioactive scaffold prepared by the aforementioned method and uses thereof. The acellular tendon scaffold prepared by the method has high biological activity, good repair effect in vivo, low immunogenicity, good biocompatibility, simple preparation method, low cost and good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导肌腱组织再生的生物活性支架及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种具有肌腱组织再生的生物活性支架的制备方法及其用途，属于生物材料领域。
技术介绍
由于疾病、创伤、退变等原因导致的肌腱损伤已成为不可忽视的健康问题。目前肌腱损伤修复的方法多种多样，包括自体肌腱移植、同种或异种肌腱移植和人工材料替代等。自体肌腱移植会造成供区疼痛、感染、损伤，同时所能供给的肌腱来源有限；同种异体肌腱移植可能引起疾病的传播，出现不同程度的排斥反应，也存在来源有限的问题；异种肌腱移植也可能引起疾病传播，但最主要的问题是存在免疫排斥反应；人工肌腱由于力学相容性较差或降解速率难与组织再生同步等问题，使得肌腱缺损修复的长期效果有待观察，且价格昂贵。理想的肌腱修复材料应具备以下条件：(1)良好的生物相容性；(2)良好的力学相容性；(3)具有诱导肌腱组织再生的潜能；(4)形状大小可控，加工制备方法有可操作性。查阅大量文献结果表明，目前使用的肌腱损伤修复材料均存在各自的缺陷和不足，因此寻求更加理想的肌腱修复材料的脚步从未停止。随着组织工程技术的发展，激励着研究人员试图通过组织工程肌腱来解决肌腱损伤修复困难这一难题。在国内外学者的共同努力探索下，组织工程肌腱的相关研究已取得巨大进展。然而，到目前为止，很多技术问题依然悬而未决：种子细胞的来源、数量以及质量等问题；缺乏理想的支架材料；外源性生长因子通过缓释技术用于组织工程肌腱时其浓度如何控制，多因子的协同作用及有序作用如何解决；体外力学刺激的作用机制及最佳的应力刺激条件尚需研究。而且传统的工程化肌腱的大规模应用，需要依赖于工程化肌腱的构建和长期保存及运输，其生产制备过程耗时，保存费用昂贵。总之，现有的组织工程肌腱产品的生物功能不甚理想，难于保存和运输，很难实现临床推广应用。因此，组织工程肌腱的发展遇到了技术瓶颈，利用传统的组织工程方法构建的组织工程肌腱尚难以用于临床实现肌腱缺损修复和再生的目标。前期研究(Preparationandcharacterizationofdecellularizedtendonslicesfortendontissueengineering.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA，2012:100A:1448–1456)和专利技术专利(专利号：ZL201310636964.0)，已经证实脱细胞肌腱切片和压片支架是较好的肌腱组织工程的支架材料。其优越性包括：(1)这些支架主要是由平行排列的I型胶原构成，具有天然肌腱的结构和组成成分；(2)具有肌腱特有的三维空间结构，有利于细胞粘附和增殖，能为细胞提供良好的生长环境并有利于细胞与支架及细胞与细胞间的信息传递；(3)加工处理过程中除去了细胞相关物质和异种抗原，抗原性显著降低；(4)保留了肌腱的基本力学强度；(5)支架的加工和处理方法相对温和，有利于保留材料中的生物活性物质；(6)动物的肌腱组织来源丰富，无需从人体组织取材，减少了创伤，避免了自体或异体肌腱组织来源受限的问题。尽管如此，上述肌腱切片或压片支架经过一系列物理加工和酶学处理，生物活性物质部分丢失，在体外诱导干细胞腱向分化或者体内促进肌腱组织再生的能力受到限制。因此，对上述肌腱切片或压片支架进行生物修饰，以增强其生物活性非常必要。目前对支架进行生物修饰以提高生物活性的方法通常是直接复合生物活性因子，但是该方法制备得到的复合支架中生物活性因子种类有限，每种因子的合适浓度难以确定，因此生物活性有限，效果不尽如人意。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新的生物活性支架及其制备方法和用途。本专利技术制备诱导肌腱组织再生的生物活性支架的方法，包括如下步骤：(1)取新鲜肌腱，脱细胞处理，得脱细胞肌腱压片或切片支架；(2)在上述支架上复合细胞外基质，即可。步骤(1)所述脱细胞肌腱压片支架的制备方法如下：1)取新鲜肌腱，清洗；2)将肌腱沿厚度方向进行压缩，压缩率为60～90％；3)对步骤2)压缩后的肌腱进行反复冻融；所述反复冻融是将步骤2)压缩后的肌腱置于液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重复操作4～6次。4)将步骤3)处理后的肌腱用核酸酶处理，清洗，即可；其中，核酸酶处理的方法为：取步骤3)处理后的肌腱，置于DNase浓度为120～180IU/ml和RNase浓度为80～120μg/ml的核酸酶溶液中，室温或37℃恒温处理6～24h。步骤(1)所述脱细胞肌腱切片支架的制备方法如下：1)取新鲜肌腱，清洗；2)将肌腱进行反复冻融；所述反复冻融是将步骤1)清洗后的肌腱置于液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重复操作4～6次；3)对步骤2)冻融处理后的肌腱沿长度方向进行冰冻切片，切片厚度为300～900μm；4)将步骤3)获得的肌腱切片用核酸酶处理，清洗，即可；其中，核酸酶处理的方法为：取步骤3)得到的肌腱切片，置于DNase浓度为120～180IU/ml和RNase浓度为80～120μg/ml的核酸酶溶液中，室温或37℃恒温处理6～24h。步骤(2)中，复合细胞外基质的方法是：a、制备脱细胞肌腱凝胶：取肌腱组织，脱细胞处理，冻干，粉碎，加入到1mg/ml的胃蛋白酶溶液中，室温消化24h，用碱中和成中性，然后加入终体积1/10的PBS溶液，置于37℃培养箱中孵育成肌腱凝胶；b、取步骤a制备的脱细胞肌腱凝胶，裱籿在步骤(1)的脱细胞肌腱压片或切片支架上，使肌腱凝胶完全覆盖肌腱压片或切片支架。步骤a中，所述脱细胞处理的步骤是：反复冻融：在液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重复操作4～6次；纵向切片：沿肌腱长度方向进行冰冻切片，切片厚度为300～900μm；核酸酶溶液处理：置于120～150IU/mlDNA酶和80～100μg/mlRNA酶中，37℃恒温摇床震荡12h；和/或，步骤a中，用0.2NNaOH中和成中性。步骤(2)中，复合细胞外基质的方法是：①取肌腱细胞或者干细胞，接种于步骤(1)的脱细胞肌腱压片或切片支架上培养；②待细胞生长至融合度为100％的致密细胞片层，进行脱细胞处理。步骤①中，所述干细胞是骨髓基质干细胞、脂肪干细胞、肌腱干细胞。步骤②中，待细胞达到90％融合时，加入50μΜVc继续培养6-8d至融合度为100％的致密细胞片层。步骤②中，所述脱细胞处理是先用含20mM氨水的0.5％TritonX-10037℃处理15min，再用100U/mLDNA酶37℃处理2h。本专利技术还提供了前述方法制备的诱导肌腱组织再生的生物活性支架。本专利技术还提供了前述的诱导肌腱组织再生的生物活性支架在制备治疗软组织缺损修复材料中的用途。其中，所述软组织缺损修复材料是肌腱组织或韧带组织缺损修复材料。本专利技术的优点在于：(1)制备的生物活性支架基底由脱细胞肌腱切片或压片构成，是天然的肌腱来源材料；(2)制备的生物活性支架经过脱细胞和去抗原处理，有效地降低了支架的抗原性；(3)制备的生物活性支架充分利用了肌腱组织的胞外基质环境，能为细胞提供良好的微环境和力学支撑，利于细胞粘附、增殖和发挥功能；(4)制备的生物活性支架具有良好的力学性能，具有与正常肌腱组织相近的力学特性，能很好的克服肌腱修复的人工材本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备诱导肌腱组织再生的生物活性支架的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)取新鲜肌腱，脱细胞处理，得脱细胞肌腱压片或切片支架；(2)在上述支架上复合细胞外基质，即可。

【技术特征摘要】
1.一种制备诱导肌腱组织再生的生物活性支架的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)取新鲜肌腱，脱细胞处理，得脱细胞肌腱压片或切片支架；(2)在上述支架上复合细胞外基质，即可。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述脱细胞肌腱压片支架的制备方法如下：1)取新鲜肌腱，清洗；2)将肌腱沿厚度方向进行压缩，压缩率为60～90％；3)对步骤2)压缩后的肌腱进行反复冻融；所述反复冻融是将步骤2)压缩后的肌腱置于液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重复操作4～6次；4)将步骤3)处理后的肌腱用核酸酶处理，清洗，即可；其中，核酸酶处理的方法为：取步骤3)处理后的肌腱，置于DNase浓度为120～180IU/ml和RNase浓度为80～120μg/ml的核酸酶溶液中，室温或37℃恒温处理6～24h。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述脱细胞肌腱切片支架的制备方法如下：1)取新鲜肌腱，清洗；2)将肌腱进行反复冻融；所述反复冻融是将步骤1)清洗后的肌腱置于液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重复操作4～6次；3)对步骤2)冻融处理后的肌腱沿长度方向进行冰冻切片，切片厚度为300～900μm；4)将步骤3)获得的肌腱切片用核酸酶处理，清洗，即可；其中，核酸酶处理的方法为：取步骤3)得到的肌腱切片，置于DNase浓度为120～180IU/ml和RNase浓度为80～120μg/ml的核酸酶溶液中，室温或37℃恒温处理6～24h。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，复合细胞外基质的方法是：a、制备脱细胞肌腱凝胶：取肌腱组织，脱细胞处理，冻干，粉碎，加入到1mg/ml的胃蛋白酶溶液中，室温消化24h，用碱中和成...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦廷武，宁良菊，张亚靖，崔静，姚璇，罗静聪，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川,51