一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法。该方法将核酸外切酶III辅助目标循环放大策略、质谱和波谱形变定量理论模型结合在一起，能够实现复杂生物样本中目标DNA的灵敏且准确的定量分析。同时，该方法克服了现有用于鉴别单核苷酸多态性方法的不足，利用质谱具有识别不同的残余DNA片段的能力，本发明专利技术提出的策略能够明确鉴别单核苷酸多态性。

An unlabeled DNA mass spectrometry quantitative analysis method based on exonuclease III assisted target cycle amplification

The invention discloses a label free DNA mass spectrometry quantitative analysis method based on exonuclease III assisted target cycle amplification. This method combines the III assisted target cycle amplification strategy, mass spectrometry and spectral deformation quantitative theoretical model, and can achieve a sensitive and accurate quantitative analysis of target DNA in complex biological samples. At the same time, this method overcomes the shortcomings of the existing methods used to identify single nucleotide polymorphisms, and the strategy can identify single nucleotide polymorphisms clearly by using the ability of mass spectrometry to identify different residual DNA fragments.

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法
本专利技术属于生物检测领域。具体涉及基于核酸外切酶III辅助循环放大策略的无标记DNA质谱定量分析方法。技术背景发展一种灵敏度高、选择性好的用于脱氧核糖核酸(DNA)检测的可靠方法对生物研究、临床诊断和生物医学等领域的发展具有非常重要的意义。在现有的DNA检测方法中，基于核酸外切酶III(ExoIII)辅助目标循环放大策略的DNA检测技术具有灵敏度高、操作简单、等温反应，特别是不需要特定的识别位点等优点，因而在生物传感
受到广泛关注。ExoIII最适合的底物是平齐或凹陷的3′末端的双链DNA，从3′羟基末端逐步切去单核苷酸。然而它的对单链DNA和3′末端凸出4个或更多碱基的双链DNA的活性非常有限，甚至完全没有活性。ExoIII为发展新型生物传感技术提供了一个优良的平台。目前，ExoIII辅助目标循环放大策略已经与各种各样的信号检测技术(如：化学发光、荧光、电化学、比色法、表面增强拉曼光谱等)相结合用于DNA的检测。然而大多数基于ExoIII或其他核酸酶的DNA检测技术涉及耗时且昂贵的生物探针的标记或复本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据目标DNA的碱基序列，设计能够与目标DNA碱基序列杂交形成双链的探针DNA，所述探针DNA的3′端为平末端，所述目标DNA的3′端为具有至少4个碱基以上的突出端；(2)往目标DNA与探针DNA的杂交反应液中加入核酸外切酶III(Exo III)，Exo III能识别由目标DNA和探针DNA杂交所形成的双链DNA的3′平末端，并沿3′端到5′端的方向酶切水解探针DNA产生单个核苷酸和残余的DNA片段，同时释放出目标DNA，释放出来的目标DNA又与第二条探针DNA杂交从而引发下一...

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸外切酶III辅助目标循环放大的无标记DNA质谱定量分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据目标DNA的碱基序列，设计能够与目标DNA碱基序列杂交形成双链的探针DNA，所述探针DNA的3′端为平末端，所述目标DNA的3′端为具有至少4个碱基以上的突出端；(2)往目标DNA与探针DNA的杂交反应液中加入核酸外切酶III(ExoIII)，ExoIII能识别由目标DNA和探针DNA杂交所形成的双链DNA的3′平末端，并沿3′端到5′端的方向酶切水解探针DNA产生单个核苷酸和残余的DNA片段，同时释放出目标DNA，释放出来的目标DNA又与第二条探针DNA杂交从而引发下一个ExoIII水解探针DNA的循环反应；经过多次循环放大后通过加热使ExoIII失活从而停止反应，得反应混合物；(3)将反应混合物通过透析纯化除去高浓度的盐离子以达到质谱检测的要求，然后使用质谱仪检测探针DNA的残余片段和未水解的探针DNA，并将带多电荷数的残余DNA序列和未水解的探针DNA序列的质谱响应构建成一条质谱数据矢量；(4)根据步骤(3)的结果，使用波谱形变定量分析理论在空白样本和标准样本的质谱数据基础上建立校正模型，并将校正模型用于复杂生物样本中目标DNA的定量分析及DNA单核苷酸多态性的特异性识别；所述空白样本是未添加探针DNA的待测实际样本，所述标准样本为目标DNA配制成的样本。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中ExoIII的酶切条件为37℃，2h。终止反应的条件为将反应混合物加热到80℃并持续10min。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)是将反应混合物通过1KD的透析膜透析纯化除去高浓度的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈增萍，石彩霞，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43