一种可临床使用的细胞冻存液制造技术

本发明专利技术提供了一种可临床使用的细胞冻存液。具体地，本发明专利技术的细胞冻存液包括以下组分：(1)人白蛋白；(2)冷冻保护剂；所述的冷冻保护剂包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇的一种或多种的组合；(3)盐缓冲液；所述的盐缓冲液为包含Na+、K+、Mg+、Cl‑和CH3COO‑离子的溶液；(4)维生素；和(5)氨基酸；其中，所述人白蛋白浓度为1％～20％(w/v)。经本发明专利技术冻存液长期冻存后的细胞，其活率高，且细胞效能保持一致性高。本发明专利技术的冻存液纯度级别为药品级或USP级，临床使用安全可靠，可用于常规的贴壁和悬浮细胞。

A clinically used cell cryopreservation solution

The invention provides a cryopreservation liquid for clinical use. Specifically, the cell cryopreservation liquid of the invention includes the following components: (1) human albumin; (2) a cryopreservation agent; the frozen protectant includes one or more combinations of two methyl sulfoxide, glycerin and ethylene glycol; (3) a salt buffer solution; the salt buffer solution is a solution containing Na+, K+, Mg+, Cl, and CH3COO ions; (4) Vitamins and (5) amino acids; among them, the albumin concentration is 1% to 20% (w/v). After cryopreservation, the viability of the cryopreservation solution is high, and the cell efficiency is highly consistent. The cryopreservation liquid of the invention is of pharmaceutical grade or USP grade, and is safe and reliable for clinical use, and can be used for conventional adherent cells and suspension cells.

【技术实现步骤摘要】
一种可临床使用的细胞冻存液
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种用于细胞长期存储的及其临床使用的冻存液。
技术介绍
在细胞培养达到需求量或目标后，需要对培养得到的细胞进行收集和保存。然而，常温和4℃的条件都不足以长期保存细胞，需要对细胞进行超低温冻存保存，这涉及到冻存液的使用。目前，常规的冻存液都由血清、或动物来源蛋白、或不满足临床使用的普通化学试剂组成，这样的冻存液一方面对细胞的活率或者效能保持的效果较差，另一方面，由于其成分无法统一，因此难以满足临床使用的标准。综上所述，本领域尚缺乏一种质量统一，适合临床使用的细胞冻存液。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种质量统一，适合临床使用的细胞冻存液。本专利技术的第一方面提供了一种可临床使用的细胞冻存液，所述的细胞冻存液包括以下组分：(1)人白蛋白；(2)冷冻保护剂：所述的冷冻保护剂包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇的一种或多种的组合；(3)盐缓冲液；所述的盐缓冲液为包含Na+、K+、Mg+、Cl-和CH3COO-离子的溶液；(4)维生素；和(5)氨基酸；其中，所述人白蛋白浓度为1％～20％(w/v)。在另一优选例中，所述的人白蛋白浓度为3～15％(w/v)，更优选为4～12％(w/v)。在另一优选例中，所述的冷冻保护剂浓度为0.4mol/L～2.2mol/L。在另一优选例中，所述的冷冻保护剂选自下组：二甲基亚砜、甘油、乙二醇、或其组合。在另一优选例中，所述的冷冻保护剂为二甲基亚砜。在另一优选例中，所述的细胞冻存液包括选自下组的一个或多个特征：Na+离子的浓度为0.1～0.2mol/L；K+离子的浓度为5～10mmol/L；Mg2+离子的浓度为1.5～5mmol/L；Cl-离子的浓度为0.1～0.3mol/L；CH3COO-离子的浓度为40～60mmol/L。在另一优选例中，所述盐缓冲液为复方电解质注射液。在另一优选例中，所述的维生素浓度为50mmol/L～150mmol/L；和/或所述氨基酸浓度为0.1mol/L～0.5mol/L。在另一优选例中，所述的人白蛋白选自下组：血浆提取人白蛋白、基因重组人白蛋白，或其组合。在另一优选例中，所述的维生素选自下组：维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K，或其组合。在另一优选例中，所述的维生素选自下组：维生素A、维生素B、维生素C、维生素E、或其组合。在另一优选例中，所述的维生素选自下组：维生素C、维生素E、或其组合。在另一优选例中，所述的氨基酸选自下组：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸，或其组合；优选为赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸，或其组合。在另一优选例中，所述的氨基酸选自下组：甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、或其组合。本专利技术的第二方面提供了一种细胞混合物，所述混合物包括以下组分：细胞，和如本专利技术第一方面所述的细胞冻存液；优选地，所述的细胞是Car-T细胞、间充质干细胞，或其组合。在另一优选例中，所述的细胞混合物是冻存后的细胞混合物。在另一优选例中，所述的细胞混合物被用于长期保存细胞和/或建立细胞库。本专利技术的第三方面提供了一种细胞的冻存方法，包括步骤：(i)将待冻存细胞与本专利技术第一方面所述的细胞冻存液进行混合，得到细胞混合物；(ii)将步骤(i)得到的细胞混合物降温后，于液氮中保存。在另一优选例中，所述步骤(i)中的待冻存细胞是通过以下步骤制备的：(i-1)提供一种活细胞，并计算活率和细胞密度；(i-2)将步骤(i-1)的细胞离心后去除上清液，弹开细胞沉淀。在另一优选例中，所述步骤(ii)中采用程序降温法梯度降温至-80度。本专利技术的第四方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒用于细胞冻存，所述的试剂盒中包括如本专利技术第一方面所述的细胞冻存液。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1为实施例1中Car-T细胞活率与冻存时间关系图。图2为实施例1中Car-T功能表达能力与冻存时间关系图。图3为实施例2中间充质干细胞活率与冻存时间关系图。图4为实施例2中冻存1月和3个月后间充质干细胞和新鲜冻存前细胞分化对照图。图5为实施例3中间充质干细胞活率与冻存时间关系图。图6为实施例3中间充质干细胞的成软骨分化情况对比图。图7为实施例4中间充质干细胞活率与冻存时间关系图。图8为实施例4中间充质干细胞的成软骨分化情况对比图。图9为对比例1中间充质干细胞活率与冻存时间关系图。图10为对比例1中间充质干细胞的成软骨分化情况对比图。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入地研究，首次发现，采用含有人白蛋白、维生素、氨基酸的冻存液保存细胞，如间充质干细胞，经过长时间保存后，细胞仍具有良好的活率和功能表达能力。在此基础上，完成了本专利技术。术语人白蛋白如本文所用术语“人白蛋白”包括血浆提取人白蛋白和基因重组人白蛋白，而在本专利技术的具体实施例和对比例中使用的“人白蛋白”指血浆提取人白蛋白，“重组人白蛋白”指基因重组人白蛋白。间充质干细胞如本文所用“间充质干细胞”是指来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件控制下分化为神经细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。CAR-T细胞如本文所用“CAR-T细胞”，即为嵌合抗原受体T细胞，是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。细胞冻存细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。如果在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，严重时引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞，贮存在低温下能减少冰晶的形成。细胞冻存中最重要的部分是细胞冻存液。传统的细胞冻存液含有动物血清，主要为胎牛血清和/或小牛血清。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种极其复杂的混合物，其一部分组成成份尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件的不同而不同。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、无机物等。细胞复苏如本专利技术所用，“细胞复苏”一词是指休眠的细胞重新活化的过程。一般采用本领域技术人员所熟知的程序即快速复苏法，将冷冻管迅速由液氮转入到温水浴中，较佳地37℃-40℃，不定时搅拌加速解冻；细胞完全解冻后，对冷冻管进行消毒；将解冻后清洗细胞并重悬，转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；检查细胞存活率及活力。细胞冻存方法在本专利技术具体实施方式中，Car-T细胞的冻存与复苏步骤：1.取一袋悬浮培养至14天的Car-T细胞，计算活率和细胞密度，取活细胞量4×108离心收集；2.离心后去上清，弹开细胞沉淀，缓缓加入20mL冻存液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可临床使用的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液包括以下组分：(1)人白蛋白；(2)冷冻保护剂，所述的冷冻保护剂包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇的一种或多种的组合；(3)盐缓冲液，所述的盐缓冲液为包含Na+、K+、Mg+、Cl‑和CH3COO‑离子的溶液；(4)维生素；和(5)氨基酸；其中，所述人白蛋白浓度为1％～20％(w/v)。

【技术特征摘要】
1.一种可临床使用的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液包括以下组分：(1)人白蛋白；(2)冷冻保护剂，所述的冷冻保护剂包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇的一种或多种的组合；(3)盐缓冲液，所述的盐缓冲液为包含Na+、K+、Mg+、Cl-和CH3COO-离子的溶液；(4)维生素；和(5)氨基酸；其中，所述人白蛋白浓度为1％～20％(w/v)。2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的冷冻保护剂浓度为0.4mol/L～2.2mol/L。3.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液包括选自下组的一个或多个特征：Na+离子的浓度为0.1～0.2mol/L；K+离子的浓度为5～10mmol/L；Mg2+离子的浓度为1.5～5mmol/L；Cl-离子的浓度为0.1～0.3mol/L；CH3COO-离子的浓度为40～60mmol/L。4.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的维生素浓度为50mmol/L～150mmol/L；和/或所述氨基酸浓度为0.1mol/L～0.5mol/L。5.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的人白蛋白选自下组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，何佳平，赵荻骏，维克多·刘，杨丁柱，
申请(专利权)人：西比曼生物科技上海有限公司，西比曼生物科技无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31