双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用及方法技术

本发明专利技术涉及一种双[2,4,6‑三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用及方法，本发明专利技术采用酶联免疫分析法，利用辣根过氧化物酶催化过氧化脲氧化3‑(4‑羟苯基)丙酸，生成能发荧光的3‑(4‑羟苯基)丙酸二聚体，进而在乙腈介质中，同双[2,4,6‑三氯苯基]草酸酯和过氧化脲反应产生强化学发光，建立了一种简单、快速、高灵敏度的测定细交链格孢菌毒素的化学发光间接竞争免疫分析方法；该方法的半抑制浓度IC50为554.63ng/L，在48.94～6084.45ng/L范围内成良好的线性关系，最低检出限LOD为14.69ng/L，能够用于赭曲霉毒素A检测。

【技术实现步骤摘要】
双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用及方法
本专利技术属于生物检测领域，涉及双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用，还涉及双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A的方法。
技术介绍
赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是一种常见的霉菌毒素，属于2B类致癌物，它具有肾毒性、肝毒性、基因毒性、致畸性、免疫毒性和胚胎毒性，毒性仅次于AFB1。由于OTA可以广泛污染农产品和食品，尤其是霉变的谷物、咖啡、豆类以及葡萄制品，是食品安全领域危害最大的污染物之一。目前国内外常用的OTA检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)、免疫亲和柱法(IAC)和胶体金免疫层析技术(GICT)等，检出限最低可达到0.1μg/L。过氧草酸酯类化学发光体系是一类高效的新型化学发光体系，这种体系除了具有发光效率高，强度大，寿命长的特点外，同时还可以通过成分选择和调节，使发光强度、持续时间和颜色满足特殊需要。在各种草酸酯类试剂中，双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯(TCPO)相比之下最为稳定，所以应用更为广泛一些。目前，以TCPO-H2O2-荧光物质化学发光体系为手段的检测方法有少量报道，主要集中在兽药残留、抗生素、葡萄球菌肠毒素C1、胆固醇、生物胺以及其他化学成分的检测，而在真菌毒素检测方面尚无相关研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用；本专利技术的目的之二在于提供基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测赭曲霉毒素A的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用。优选的，所述测定使用化学发光酶联免疫分析法。优选的，所述化学发光是基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯─H2O2─3-(4-羟苯基)丙酸二聚体化学发光体系。2、基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：在酶标板中包被赭曲霉毒素A抗原，封闭后加入OTA标准品作为竞争抗原，然后加入赭曲霉毒素A一抗，再加入酶标二抗孵育，加入过氧化脲与3-(4-羟苯基)丙酸混合液酶催化反应后，转移至另一白色酶标板中，加入含咪唑的过氧化脲，混匀后加入双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液显色，酶标仪检测。优选的，所述包被为将浓度为0.5～1.5μg/mL的BSA修饰赭曲霉毒素A加入酶标板中，4℃过夜。优选的，所述封闭为将脱脂奶粉溶液于37℃温育1h；甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次3min，所述脱脂奶粉溶液为每1.0g脱脂奶粉溶于20mLPBST的溶液。优选的，所述一抗使用浓度为稀释10000～40000倍。优选的，所述酶标二抗孵育为将HRP标记的羊抗鼠抗体稀释2000～4000倍，温育，甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板5次，每次至少3min。优选的，所述酶催化反应为将过氧化脲与3-(4-羟苯基)丙酸混合，控制pH值为6.0，温育5～30min；混合后所述过氧化脲浓度为5.0×10-3～13×10-3mol/L；所述3-(4-羟苯基)丙酸浓度为5×10-3～13×10-3mol/L。优选的，所述显色为加入含咪唑的过氧化脲溶液，溶液中过氧化脲浓度为0.5～4mol/L，所述咪唑浓度为2×10-3mol/L，混匀后加入浓度为5～20×10-3mol/L的双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液。本专利技术的有益效果在于：本专利技术基于TCPO-H2O2-PHPPADimer体系的化学发光酶联免疫检测方法，将其首次应用于真菌毒素赭曲霉毒素的检测；本专利技术通过酶联免疫分析法，辣根过氧化物酶催化过氧化脲氧化3-(4-羟苯基)丙酸(PHPPA)，生成能发荧光的3-(4-羟苯基)丙酸二聚体(PHPPADimer)。进而在乙腈介质中，在增强剂咪唑的参与下，同双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯和过氧化脲反应产生强化学发光；并且通过合理选择有机溶剂、避免水相体系的引入，解决过氧化草酸酯发光试剂难溶于水的问题，该方法的IC50为554.62ng/L，线性回归方程为y＝45.418-35.33x，检测范围48.94～6084.45ng/L，最低检测限14.69ng/L，葡萄干样品的平均回收率为84.55％-91.36％，葡萄汁样品的平均回收率为73.32％-87.％。该方法的平均批内变异系数为4.40％，批间变异系数为7.37％，均小于10％，表明精密度较好。用该方法获得的结果与传统的酶联免疫分析法和鲁米诺化学发光分析方法进行了比较，得到了更为理想的结果。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为不同包被浓度对icCLEIA的影响。图2为单抗浓度对icCLEIA的影响。图3为酶标二抗稀释度对icCLEIA的影响。图4为过氧化脲浓度对icCLEIA的影响。图5为PHPPA浓度对icCLEIA的影响。图6为酶反应时间对icCLEIA的影响。图7为TCPO浓度对icCLEIA的影响。图8为过氧化脲乙腈溶液浓度对icCLEIA的影响。图9为icCLEIA标准工作曲线(n＝3)。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。本专利技术实施例所用仪器如下：恒温培养箱(长城科工贸有限公司)、SynengH1MG多功能酶标仪(GeneCompanyLimited公司)、pHS-4C酸度计(上海科学仪器公司)、JS系列电子天平(精度0.0001g)(上海精天电子仪器有限公司)、HJ-3恒温数显磁力搅拌器(江苏科析有限公司)、单通道、多通道移液器(德国Eppendorf公司)、96孔可拆化学发光酶标板(上海生工生物有限公司)。所用试剂如下：双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯(TCPO)、3-(4-羟苯基)丙酸(PHPPA)、过氧化脲(CH4N2O·H2O2)均购于美国sigma公司，赭曲霉毒素A标准品(新加坡Pribolab公司)、赭曲霉毒素A单克隆抗体、抗原(北京沫之东生物技术有限公司)、羊抗小鼠IgG-HRP(武汉博士德公司)、咪唑(天津市远航化学品有限公司)，乙腈、HCl、Na2CO3、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、Tween-20(成都科龙化工试剂公司)，脱脂奶粉、葡萄汁、葡萄干(购于本地超市)，所有试剂均为分析纯，水为超纯水。包被缓冲液(CBS)是pH9.60.05mol/L碳酸盐缓冲溶液；pH7.40.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)通过溶解0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，8.0gNaCl，0.2gKCl在1升水中制得；洗涤液(PBST)为含有0.05％Tween-20的0.01mol/LPBS缓冲液溶液。过氧化脲和PHPPA工作液用pH6.0PBS按照一定比例稀释而成。TCPO，CH4N2O·H2O2(含咪唑)工作液是用无水乙腈稀释至所需浓度。实施例1构建检测赭曲霉毒素A(OTA)的化学发光酶联免疫分析法(icCLIA)，具体步骤如下：(1)包被：包被缓冲液CBS稀释包被原OTA-BSA至1.0μg/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.双[2,4,6‑三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用。

【技术特征摘要】
1.双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定赭曲霉毒素A中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述测定使用化学发光酶联免疫分析法。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述化学发光是基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯─H2O2─3-(4-羟苯基)丙酸二聚体化学发光体系。4.基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：在酶标板中包被赭曲霉毒素A抗原，封闭后加入OTA标准品作为竞争抗原，然后加入赭曲霉毒素A一抗，再加入酶标二抗孵育，加入过氧化脲与3-(4-羟苯基)丙酸混合液酶催化反应后，转移至另一白色酶标板中，加入含咪唑的过氧化脲，混匀后加入双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液显色，酶标仪检测。5.根据权利要求4所述基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：所述包被为将浓度为0.5～1.5μg/mL的BSA修饰赭曲霉毒素A加入酶标板中，4℃过夜。6.根据权利要求4所述基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：所述封闭为将脱脂奶粉溶液于37℃温育1h；甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次3min，所述脱脂奶粉...

【专利技术属性】
技术研发人员：马良，潘姝历，张宇昊，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50