应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法技术

应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下工艺步骤：1）种细胞的培养；2）繁殖病毒用细胞的悬浮培养；3）病毒的培养与收获。本发明专利技术可以缩短生产周期，降低人员配置，污染几率低，占地面积小，并且得到的病毒滴度高，批间差异小。

【技术实现步骤摘要】
应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法。
技术介绍
小鹅瘟（GoslingPlague，GP）是由小鹅瘟病毒（GoslingPlagueVirus，GPV）引起的雏鹅急性或者亚急性的败血性传染病。本病主要侵害出壳后30日龄以内的雏鹅及雏番鸭，具有传播快，发病率和死亡率高的特点，死亡率可达90%~100%。1956年，方定一首先在我国扬州发现本病，并于1961年用鹅胚分离到该病毒。1965年后，在匈牙利、德国、荷兰、前苏联、意大利、英国、法国、南斯拉夫、越南、以色列等国家先后报道了该病的存在。目前世界许多饲养鹅及番鸭地区都有本病的爆发和流行。GPV是细小病毒科（Parvoviridae），细小病毒属（Parvovirinae）中的细小病毒（Parvovirus）成员，为无囊膜，单链DNA病毒，直径为20~22nm，是目前已知的动物病毒中较小、较简单病毒之一。鹅细小病毒以肠道栓塞为特征性病变，该病发病急，死亡率高，是危害养鹅业的主要传染病之一。病鹅表现为精神萎顿、昏睡、食欲废绝、排出灰白色或者淡黄色稀粪便、混有气泡、肛门外突，周围被毛潮湿并有污染物。临死前出现两腿麻痹或者抽搐症状。目前小鹅瘟无有效治疗药物，最有效的办法是对健康鹅实施疫苗接种加以预防。目前繁殖培养小鹅瘟病毒的方法基本上为鹅胚培养法、鸭胚培养法以及转瓶鹅胚原代成纤维细胞培养法。直接采用胚体进行病毒繁殖易受非免疫胚体来源限制，同时采用胚体繁殖病毒，由于培养的病毒悬液中含有大量杂蛋白会给后续疫苗制备带来安全隐患，另外胚体废弃物处理不当也会存在散毒的危险。转瓶原代细胞培养技术虽然比较成熟，但是制备原代成纤维细胞工序繁琐，并且批次间差异较大，培养的病毒量小毒价低，同时也存在胚体源外源病毒污染的生物安全隐患。近年来，生物反应器和微载体技术培养细胞、繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。与传统的胚体和转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术有着巨大的优势：首先单位体积内有效工作细胞数量增加；其次全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动强度的同时减少人为操作因素影响；再者生物反应器容积的扩大，提高了产品的均一性，也提高了产品的产量和质量；最后生产疫苗所用的成本远低于传统胚体培养工艺与转瓶培养工艺，综合成本大大降低。我国的生物反应器悬浮培养技术起步较晚，但近几年该技术在国内的发展非常快。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法的技术方案，该方法可以缩短生产周期，降低人员配置，污染几率低，占地面积小，并且得到的病毒滴度高，批间差异小。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）种细胞的培养：用细胞生长液对种细胞进行培养；2）繁殖病毒用细胞的悬浮培养：将步骤1）培养得到的种细胞悬浮液接种至灌注袋中，吸附后在生物反应器中加入细胞生长液进行悬浮培养；3）病毒的培养与收获：将小鹅瘟病毒悬液接种于生物反应器中，换用维持液进行培养，接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近0时，即开始收获病毒，收获病毒后，反复冻融灌注袋，收获全悬病毒液，经检验合格后置于-20℃保存。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤1）中种细胞为鹅胚传代细胞系CGBQ。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤1）中种细胞采用方瓶培养法、转瓶培养法或微型反应器培养法进行培养。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤2）中生物反应器为激流灌注式生物反应器、搅拌式生物反应器或潮汐式生物反应器。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤2）中生物反应器的微载体类型为聚酯纤维纸片，使用前用灭菌PBS浸泡过夜。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤2）中悬浮培养条件为：温度37～38℃，pH7.0～7.6，溶解氧30%～60%，接种量为3～6×109个细胞。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤2）中悬浮培养时根据细胞糖耗情况随时补糖或者补加细胞生长液，确保残糖不低于2g/L。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的步骤3）中培养条件为：温度37～38℃，pH7.4～7.6，溶解氧30%～50%。所述的应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%Ham’sF12K或者DMEM、10%胎牛血清，其pH为7.0～7.6、溶解氧为30%～60%，含糖4.0g/L；所述的维持液含97%Ham’sF12K或者DMEM、3%胎牛血清，其pH为7.4～7.6、溶解氧为30%～50%，含糖4.0g/L。本专利技术中Ham’sF12K和DMEM均为现有产品，在市场上均能购得。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术采用鹅胚细胞系培养法，避免了胚体培养中大量杂蛋白的影响，不含因胚体带来的外源病毒，也消除了对环境造成的安全隐患。本专利技术制备的病毒抗原纯净品质均一、稳定，使用安全无污染。本专利技术在培养细胞时根据糖耗情况随时补加营养，确保细胞的密度，同时提高病毒的滴度。本专利技术采用了先进的悬浮培养设备与技术：（1）以糖耗为技术指标以及先进的控制系统；（2）在细胞培养方面增加了细胞密度；（3）在培养病毒时提高了病毒滴度；（4）可使后续制备的疫苗效价大大提高，同时降低了疫苗的副反应。（5）采用了连续、完全封闭的细胞与病毒培养方式，完善了生产过程中的可控性，确保病毒悬液的稳定性。附图说明图1为本专利技术的工艺流程图。具体实施方式为了使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。实施例1用鹅胚传代细胞系在AP20C型激流灌注式反应器上培养繁殖小鹅瘟病毒，包括如下步骤：（1）生物反应器的选择：激流式反应器AP-20C型，体积为10L；（2）细胞的选择：鹅胚传代细胞系CGBQ，适合小鹅瘟病毒生长的传代细胞系，无致癌性，购于美国菌种保藏中心；（3）病毒毒株的选择：选用小鹅瘟病毒SHM319株，微生物保藏号：ATCCVR-696，保藏于美国菌种保藏中心，可在美国菌种保藏中心购得；（4）种细胞的培养：利用T175方瓶中的细胞生长液繁殖CGBQ细胞，一般按1:3～1:5传代，待细胞长满单层后消化、计数，将细胞悬液接种至转管中，每管接种细胞约3×107个细胞，置微型反应器中进行培养，反应器温度设置为37℃，转速设置为42rpm；（5）繁殖病毒用细胞的悬浮培养：首先准备生物反应器：检漏激流袋和灌注袋；采用灭菌PBS浸泡微载体过夜；校正温度电极、pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌；组装生物反应器，注入细胞生产液，循环24小时进行系统的无菌检验。验证合格后，将步骤（3）中培养好的种子细胞消化、计本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于包括以下工艺步骤 ：（1）生物反应器的选择 ：激流式反应器 AP‑20C 型，体积为 10L ；（2）细胞的选择 ：鹅胚传代细胞系 CGBQ ；（3）病毒毒株的选择 ：选用小鹅瘟病毒 SHM 319 株 ；（4）种细胞的培养 ：利用 T175 方瓶中的细胞生长液繁殖 CGBQ 细胞，按 1:3 ～ 1:5 传代，待细胞长满单层后消化、计数，将细胞悬液接种至转管中，每管接种细胞 3×107 个细胞，置微型反应器中进行培养，反应器温度设置为 37℃，转速设置为 42rpm ；（5）繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ：首先准备生物反应器 ：检漏激流袋和灌注袋 ；采用灭菌PBS浸泡微载体过夜 ；校正温度电极、pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌 ；组装生物反应器，注入细胞生产液，循环 24 小时进行系统的无菌检验 ；验证合格后，将步骤（4）中培养好的种子细胞消化、计数，无菌条件下按3～6×109个细胞接种至灌注袋中，在温度37～38℃下，以 40rpm、60rpm、90rpm、120rpm 各循环 30min，使细胞贴壁，然后开始 150rpm 循环 ；培养过程中适时测定糖耗，当残糖量至 2g/L 时，进行补糖或补加培养液 ；（6）所述步骤（4）和步骤（5）细胞生长液含 90% Ham’s F12K、10% 胎牛血清，细胞生长液的 pH 为 7.0 ～ 7.6，DO 为 30% ～ 60%，含糖 4.0g/L ；（7）病毒的培养与收获 ：当细胞培养4～6天，当糖耗达到最大时，将小鹅瘟病毒悬液按0.01 ～ 1.0MOI 的接种量接种于激流灌注式生物反应器中，换用维持液进行培养 ；接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近 0 时，即开始收获病毒 ；收获病毒后，反复冻融灌注袋内细胞，收获全悬病毒液 ；（8）所述步骤（7）中的细胞维持液含 97% Ham’s F12K、3% 胎牛血清，维持液的 pH 为7.4 ～ 7.6，DO 为 30% ～ 50%，含糖 4.0g/L。...

【技术特征摘要】
1.应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：（1）生物反应器的选择：激流式反应器AP-20C型，体积为10L；（2）细胞的选择：鹅胚传代细胞系CGBQ；（3）病毒毒株的选择：选用小鹅瘟病毒SHM319株；（4）种细胞的培养：利用T175方瓶中的细胞生长液繁殖CGBQ细胞，按1:3～1:5传代，待细胞长满单层后消化、计数，将细胞悬液接种至转管中，每管接种细胞3×107个细胞，置微型反应器中进行培养，反应器温度设置为37℃，转速设置为42rpm；（5）繁殖病毒用细胞的悬浮培养：首先准备生物反应器：检漏激流袋和灌注袋；采用灭菌PBS浸泡微载体过夜；校正温度电极、pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌；组装生物反应器，注入细胞生产液，循环24小时进行系统的无菌检验；验证合格后，将步骤（4）中培养好的种子细胞消化、计数，无菌条件下按3～6×109个细...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁十义，
申请(专利权)人：宁波高新区绿元汇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33