一种小鼠IL-38的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种小鼠IL‑38的生产方法。采用基因工程方法生产，该方法包括以下步骤：1)小鼠IL‑38基因密码子优化与合成；2)PCR引物合成；3)PCR扩增获得小鼠IL‑38片段；4)构建pET28a‑mIL‑38重组载体；5)将pET‑28a‑mIL‑38转化大肠杆菌BL21，构建小鼠IL‑38基因工程菌；6)培养小鼠IL‑38基因工程菌，诱导小鼠IL‑38蛋白表达，该工程菌表达的重组IL‑38主要为可溶蛋白；7)用Ni‑NAT对表达的小鼠IL‑38蛋白进行纯化即可得到较高纯度的小鼠IL‑38蛋白。小鼠IL‑38蛋白的成功制备，为探究IL‑38在各种小鼠炎症疾病模型中的作用及其分子机制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠IL-38的生产方法
本专利技术属于基因工程领域。具体涉及一种小鼠IL-38的生产方法。
技术介绍
白细胞介素-38(interleukin-38，IL-38)是新近发现的IL-1家族细胞因子，人IL-38基因定于2号染色体2q13-14.1，与编码IL-1Ra(IL-1的受体拮抗剂)和IL-36Ra的基因位点相邻。IL-38基因包含5个外显子，编码一个由152个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子质量约为16.9kDa。IL-38在多种组织都有表达，如心脏、胎盘、胎儿肝、皮肤、脾、胸腺、扁桃体等。序列分析表明，IL-38蛋白与IL-1Ra、IL-36Ra蛋白的氨基酸组成具有较高同源性，分别为41％和43％。与IL-36R的结合能力比较研究发现，高浓度的IL-38明显高于同浓度的IL-36Ra，提示高浓度的IL-38在IL-36R介导的炎性途径中可能较IL-36Ra具有更强的受体拮抗剂作用。IL-38能抑制念珠菌属刺激人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)产生Th17相关细胞因子(IL-17A和IL-22)，并能减少IL-36γ刺激PBMC产生的IL-8，抑制炎症反应。鉴于IL-38在炎症反应中的重要作用，有必要在小鼠疾病模型中对其作用机制进行研究，所以急需开发一种可以大量表达并制备高纯度小鼠IL-38蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小鼠IL-38蛋白的生产方法。本专利技术采用的技术方案是：一种小鼠IL-38的生产方法，采用基因工程技术生产，所述的基因工程技术包括以下步骤：1)构建pUC57-mIL-38质粒：合成小鼠IL-38基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-38质粒；2)PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，以pUC57-mIL-38质粒为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物P1和P2的序列为：P1：5’-GGGGAATTCATGTGCTCTCTGCCGATG-3’P2：5’-CCCAAGCTTACGGCTCATTTCAAAATAAAAT-3’PCR反应体系为：2×PfuMasterMix25μL，P1、P2引物各2μL，pUC57-mIL-38质粒模板0.2μL，加双蒸水补充至50μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。3)pET28a-mIL-38重组表达载体的构建：将PCR扩增产物和pET28a载体质粒分别用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切，双酶切后凝胶回收mIL-38与pET28a载体，回收后的mIL-38与pET28a载体经T4连接酶定向连接，构建原核表达质粒pET28a-mIL-38；4)转化：将原核表达质粒pET28a-mIL-38转化大肠杆菌BL21，获得IL-38重组工程菌；5)小鼠IL-38蛋白的诱导表达：将IL-38重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、200r/min震荡培养过夜；次日，以1:50比例扩大培养，37℃、210r/min震荡培养1.5～2h，至OD600达到0.6时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG进行诱导表达，PCR诱导条件为：20℃，100r/min，20h，获得菌体；6)小鼠IL-38蛋白的纯化：采用超声破碎法将获得的菌体裂解，离心取上清液，用Ni-NAT对上清液进行纯化，得纯化的IL-38蛋白。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术建立了小鼠IL-38的生产方法，采用基因工程技术，根据需求构建得到小鼠IL-38基因工程菌，能使小鼠IL-38高效表达，由于该工程菌表达的小鼠IL-38主要为可溶性成分，纯化后相对的生物学活性较高。2.本专利技术，由于表达的小鼠IL-38蛋白C端带有6×His-Tags，用Ni-NAT进行纯化即可得到较高纯度的IL-38蛋白。3.本专利技术成功制备小鼠IL-38蛋白，为探究IL-38在炎症性疾病中的作用及相关机制等研究提供了前提，并为开发预治炎症及自身免疫性疾病的新型临床药物奠定了基础。附图说明图1是pUC57-mIL-38质粒双酶切结果；其中，1：M：DNA标准分子量；pUC57-mIL-38质粒双酶切结果。图2是小鼠IL-38基因扩增结果图；其中，M：DNA标准分子量；1：IL-38PCR结果。图3重组质粒pET-28a-mIL-38的构建图谱。图4是重组质粒pET28a-mIL-38测序结果。图5是表达及纯化后小鼠IL-38蛋白的SDS-PAGE分析图谱；其中，M：蛋白质标准分子量；1：未诱导细菌总蛋白；2诱导后细菌总蛋白；3：细菌破壁后沉淀总蛋白；4：细菌破壁后上清总蛋白；5：纯化后的小鼠IL-38蛋白。具体实施方式1)构建pUC57-mIL-38质粒：优化小鼠IL-38基因密码子，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成小鼠IL-38基因，克隆入pUC57，构建pUC57-mIL-38质粒。小鼠IL-38基因的DNA如SEQIDNO.1所示。经SmaⅠ和BamHI双酶切验证，双酶切结果如图1所示，由图1可见，经酶切，pUC57-mIL-38质粒在正确位置出现载体条带与目的DNA片段，质粒构建成功。2)PCR引物的合成根据优化的小鼠IL-38基因序列设计并合成一对PCR引物，在引物的两侧导入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点：上游引物P1：5’-GGGGAATTCATGTGCTCTCTGCCGATG-3’(下划线处为EcoRⅠ)，下游引物P2：5’-CCCAAGCTTACGGCTCATTTCAAAATAAAAT-3’(下划线处为HindⅢ)。3)PCR扩增小鼠IL-38基因以pUC57-mIL-38质粒为模板，以上游引物P1和下游引物P2进行PCR扩增，获得小鼠IL-38基因片段。PCR反应体系如下:2×PfuMasterMix25μL，上、下游引物各2μL，pUC57-mIL-38质粒模板0.2μL，加双蒸水补充至50μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，结果如图2所示，如图2可见，以pUC57-mIL-38质粒为模板扩增出小鼠IL-38基因序列，序列459bp，与电泳结果相符。4)pET28a-mIL-38重组表达载体的构建将PCR扩增产物和pET28a载体质粒分别用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切。双酶切后凝胶回收mIL-38与pET28a载体，回收后的mIL-38与pET28a载体经T4连接酶定向连接，构建原核表达质粒pET28a-mIL-38。重组表达载体pET28a-mIL-38的构建图谱如图3所示。5)转化将原核表达质粒pET28a-mIL-38转化感受态受体菌大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化产物涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板培养基上，37℃培养约14h，次日挑取培养皿上单菌落，并用菌落PCR鉴定阳性重组子。挑取阳性菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养14h，提取重组质粒，进行酶切验证。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠IL‑38的生产方法，其特征在于，采用基因工程技术生产，所述的基因工程技术包括以下步骤：1)构建pUC57‑mIL‑38质粒：合成小鼠IL‑38基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57‑mIL‑38质粒；2)PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，以pUC57‑mIL‑38质粒为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物P1和P2的序列为：P1：5’‑GGGGAATTCATGTGCTCTCTGCCGATG‑3’P2：5’‑CCCAAGCTTACGGCTCATTTCAAAATAAAAT‑3’3)pET28a‑mIL‑38重组表达载体的构建：将PCR扩增产物和pET28a载体质粒分别用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切，双酶切后凝胶回收mIL‑38与pET28a载体，回收后的mIL‑38与pET28a载体经T4连接酶定向连接，构建原核表达质粒pET28a‑mIL‑38；4)转化：将原核表达质粒pET28a‑mIL‑38转化大肠杆菌BL21，获得IL‑38重组工程菌；5)小鼠IL‑38蛋白的诱导表达：将IL‑38重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃、200r/min震荡培养过夜；次日，以1:50比例扩大培养，37℃、210r/min震荡培养1.5～2h，至OD600达到0.6时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG进行诱导表达，获得菌体；6)小鼠IL‑38蛋白的纯化：采用超声破碎法将获得的菌体裂解，离心取上清液，用Ni‑NAT对上清液进行纯化，得纯化的IL‑38蛋白。...

【技术特征摘要】
1.一种小鼠IL-38的生产方法，其特征在于，采用基因工程技术生产，所述的基因工程技术包括以下步骤：1)构建pUC57-mIL-38质粒：合成小鼠IL-38基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-38质粒；2)PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，以pUC57-mIL-38质粒为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物P1和P2的序列为：P1：5’-GGGGAATTCATGTGCTCTCTGCCGATG-3’P2：5’-CCCAAGCTTACGGCTCATTTCAAAATAAAAT-3’3)pET28a-mIL-38重组表达载体的构建：将PCR扩增产物和pET28a载体质粒分别用EcoRⅠ、HindⅢ进行双酶切，双酶切后凝胶回收mIL-38与pET28a载体，回收后的mIL-38与pET28a载体经T4连接酶定向连接，构建原核表达质粒pET28a-mIL-38；4)转化：将原核表达质粒pET28a-mIL-38转化大肠杆菌BL21，获得IL-38重组工程菌；5)小鼠IL-38蛋白的诱导表达：将IL-...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱俊丰，李雪，蒙新睿，徐莹，赵健，李辉，刘宏生，华子雯，陈光辉，李鑫然，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21