一种荷花无菌苗获取的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种荷花无菌苗获取的构建方法,属于植物组织培养技术领域。本发明专利技术包括以下步骤：(1)灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子在无菌操作台上用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒备用；(2)破壳浸泡：用修枝剪破壳，将已经破壳的荷花种子整平浸泡在无菌水中7h以上，种子吸水膨胀，种壳同子叶分离；(3)剥除种壳：把种子外的种皮剥除，将无种壳的种子在75％的酒精中浸泡2min消毒，取出种子晾干。(4)获得种胚：待种子表面的水分蒸发后用手将已吸水膨胀的种子捏开，用镊子将种胚取下。(5)初选接种：对胚进行初选，将初选合格的胚接种在MS培养基上。本发明专利技术显著提高了莲子的利用率、成活率，并且把污染率、损耗率降至最低。

Construction of an aseptic seedling of lotus

The invention relates to a method for obtaining a lotus flower aseptic seedling, belonging to the technical field of plant tissue culture. The invention includes the following steps: (1) sterilization: the round and full lotus seed of \Guangchang white lotus\ is selected to be sterilized on the sterile table with 75% alcohol and 3% sodium hypochlorite; (2) the shell is soaked with pruning, and the broken shell is soaked in the water free water and soaked in more than 7h, the seed is swellable and the seed shell is the same. Cotyledon separation; (3) peel off seed shell: remove seed coat from seed, soak seedless seeds in 75% alcohol, disinfect 2min, remove seeds and dry. (4) get the embryo: when the moisture on the surface of the seed is evaporated, the seeds that are swollen and swollen will be pinched open by hand, and the embryo will be removed by tweezers. (5) primary inoculation: primary selection of embryos, inoculation of primed embryos on MS medium. The invention significantly improves the utilization rate and survival rate of lotus seeds and minimizes the pollution rate and wastage rate.

【技术实现步骤摘要】
一种荷花无菌苗获取的构建方法
本专利技术属于植物组织培养
，涉及一种荷花无菌苗获取的构建方法。
技术介绍
荷花(NelumbonuciferaGaertn.)为莲科莲属多年生水生花卉,是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值、经济价值和独特的文化内涵，深受人们喜爱。随着生理、生化等相关学科的发展,并且伴随组织培养技术的日益完善,科研工作者往往会采用生物技术创造新种质，如：结合基因工程将抗病基因、抗旱基因等转入栽培品种,开辟改良抗病性、抗旱性的新途径；也可以与多倍体诱导相结合，以加速和丰富荷花的多倍体育种；还可以与分子生物学方法结合起来，在细胞水平上进行遗传修饰，以改良荷花品种。荷花的遗传转化体系尚不完善，目前仅见泰国Buathong等(2013)的报道：以荷花成熟胚培养出的无菌苗的茎尖作为外植体诱导出愈伤组织，对愈伤组织采用基因枪法转入DFR基因，然后对愈伤组织诱导不定芽分化成苗。武汉大学生命科学院胡中立教授(2015)以太空连36号1周龄幼胚诱导丛生芽。试验过程中需从莲子中取出种胚，培育无菌苗，过程费时费力，操作难度大，损耗率极高，污染率高且成活率都不高。现有技术常用硫酸腐蚀莲子、直接消毒、修枝剪破壳的方法，具有导致荷花种子致死、操作难度大、过程复杂和成活率低的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种荷花无菌苗获取的构建方法，以解决现有技术培育过程费时费力，操作难度大，损耗率极高，污染率高且成活率都不高的问题。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种荷花无菌苗获取的构建方法，包括以下步骤：(1)灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子在无菌操作台上用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒灭菌备用；(2)破壳浸泡：用修枝剪破壳，破壳部位在荷花种子萌发孔正对面的种蒂处，将已经破壳的荷花种子整平浸泡在无菌水中7h以上，浸泡完成后，种子吸水膨胀，种壳同子叶分离；(3)剥除种壳：在超净工作台上将浸泡用的容器中的水倒出，用无菌水洗一次种子，把浸泡时产生的浑浊的水洗净，把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，将无种壳的种子在75％的酒精中浸泡1-5min消毒，取出种子晾干待用；(4)获得种胚：待种子表面的水分蒸发后用手将已吸水膨胀的种子捏开，用镊子将种胚取下；(5)初选接种：对胚进行初选，将初选合格的胚接种在MS培养基上，培养无菌苗，所述培养基配方如下：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖。优选的，步骤(1)灭菌的具体方法为选取“广昌白莲”的圆形饱满的种子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，备用。优选的，步骤(2)中用修枝剪破壳的程度为不破环包裹在子叶外的种皮；优选的，步骤(2)浸泡时，种子与水的比例为2：3。优选的，步骤(3)中将种皮剥除后，于75％酒精中浸泡2min，晾干备用。优选的，步骤(4)中弃用胚囊进水的种子。优选的，步骤(5)中初选过程中选择已经转绿的，胚饱满且有活性的胚进行接种。本专利技术的有益效果：本专利技术采用不同于以往的破壳方法，有针对性避开莲子最薄弱的萌发孔，通过莲子自我吸水膨胀萌发的特性，简化破壳，取胚的操作难度和过程，克服了现有技术的用硫酸腐蚀莲子、直接消毒、修枝剪破壳等方法易致死、难度大、过程复杂等缺陷，显著提高了莲子的利用率、成活率，并且把污染率、损耗率降至最低。进一步的，步骤(2)中用修枝剪破壳的程度为不破环包裹在子叶外的种皮，因为这样可以保证水分是经过厚大子叶的天然过滤作用后被胚吸收，最大程度的保证无菌环境，把污染率、损耗率降至最低。进一步的，由于浸泡过程中会有小部分胚囊进水，此种胚污染风险很大，挑选出这种胚，得以避免在培育过程中造成污染，提高莲子的利用率、成活率。进一步的，对所有获得的种胚进行初选，以获得更大的成活率，并降低污染率，保证了培育的荷花的质量和成活率。具体实施方式通过以下实施例对本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例1一种荷花再生体系的构建方法，按以下步骤进行：(一)培养基的配制无菌苗培养基：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖(二)灭菌及破壳：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次后，放入3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，在萌发孔正对面的种蒂处用修枝剪破壳，破壳时，要掌握破壳的程度，以不破环包裹在子叶外的种皮为宜，因为这样可以保证水分是经过厚大子叶的天然过滤作用后被胚吸收，最大程度的保证无菌环境；加无菌水浸泡大约7h左右，种子即可吸水变软，加水不宜过多，也不宜过少，以能淹没所有种子为宜。之后整平待用。将超净工作台，无菌水，酒精，滤纸，培养基，废液瓶等紫外灭菌。先用无菌水洗一次种子，把浸泡时出的浑浊的水洗干净。把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，剩下的种子待表面水分蒸发后，放入瓶中加75％的酒精浸泡1min。弃用胚囊进水的种子，剩下的种子待表面的水分蒸发后，取出子叶包裹的胚。进行初选，只选择已经转绿的，胚非常饱满且具有活性的接种。(三)无菌苗的培养：将取出的莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中，每瓶接种3个，各接种26瓶，每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，控温25℃，1周后获得无菌苗。统计无菌苗成活率和污染率。成活率＝成活的无菌苗数(不包括污染了被剔除的)/接种莲心×100％，污染率＝污染无菌苗数/总接种数×100％。26瓶中仅有1瓶污染，污染率仅3.85％，成活率100％。实施例2一种荷花再生体系的构建方法，按以下步骤进行：(一)培养基的配制无菌苗培养基：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖(二)灭菌及破壳：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子用75％的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次后，放入3％次氯酸钠浸泡8min，再用无菌水冲洗3次，在萌发孔正对面的种蒂处用修枝剪破壳，破壳时，要掌握破壳的程度，以不破环包裹在子叶外的种皮为宜，因为这样可以保证水分是经过厚大子叶的天然过滤作用后被胚吸收，最大程度的保证无菌环境；加无菌水浸泡大约7h左右，种子即可吸水变软。之后整平待用。将超净工作台，适宜的无菌水，酒精，滤纸，培养基，废液瓶等紫外灭菌。先用无菌水洗一次种子，把浸泡时出的浑浊的水洗干净。把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，待表面水分蒸发后，放入瓶中加75％的酒精浸泡1min。待表面的水分蒸发后，取出子叶包裹的胚。进行初选，只选择已经转绿的，胚非常饱满的接种。(三)无菌苗的培养：将取出的莲心作为外植体接种于无菌苗培养基中，每瓶接种3个，各接种23瓶,每天光照时间为14h，光照强度1500-2500Lx，控温25℃，1周后获得无菌苗。统计无菌苗成活率和污染率。成活率＝成活的无菌苗数(不包括污染了被剔除的)/接种莲心×100％，污染率＝污染无菌苗数/总接种数×100％。23瓶中仅有1瓶污染，污染率仅4.35％，成活率100％。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荷花无菌苗获取的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子在无菌操作台上用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒灭菌备用；(2)破壳浸泡：用修枝剪破壳，破壳部位在荷花种子萌发孔正对面的种蒂处，将已经破壳的荷花种子整平浸泡在无菌水中7h以上，浸泡完成后，种子吸水膨胀，种壳同子叶分离；(3)剥除种壳：在超净工作台上将浸泡用的容器中的水倒出，用无菌水洗一次种子，把浸泡时产生的浑浊的水洗净，把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，将无种壳的种子在75％的酒精中浸泡1‑5min消毒，取出种子晾干待用；(4)获得种胚：待种子表面的水分蒸发后用手将已吸水膨胀的种子捏开，用镊子将种胚取下；(5)初选接种：对胚进行初选，将初选合格的胚接种在MS培养基上，培养无菌苗，所述培养基配方如下：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖。

【技术特征摘要】
1.一种荷花无菌苗获取的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)灭菌：选取“广昌白莲”的圆形饱满的莲子在无菌操作台上用75％的酒精和3％次氯酸钠消毒灭菌备用；(2)破壳浸泡：用修枝剪破壳，破壳部位在荷花种子萌发孔正对面的种蒂处，将已经破壳的荷花种子整平浸泡在无菌水中7h以上，浸泡完成后，种子吸水膨胀，种壳同子叶分离；(3)剥除种壳：在超净工作台上将浸泡用的容器中的水倒出，用无菌水洗一次种子，把浸泡时产生的浑浊的水洗净，把种子外的种皮在不破坏子叶完整性的前提下剥除，将无种壳的种子在75％的酒精中浸泡1-5min消毒，取出种子晾干待用；(4)获得种胚：待种子表面的水分蒸发后用手将已吸水膨胀的种子捏开，用镊子将种胚取下；(5)初选接种：对胚进行初选，将初选合格的胚接种在MS培养基上，培养无菌苗，所述培养基配方如下：MS+8g/L琼脂+30g/L蔗糖。2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐迎春，王华，金奇江，王彦杰，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京花漫溪农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32