结晶金属－α－干扰素制造技术

单斜晶形态的结晶锌－α－２－ＩＦＮ。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本专利技术涉及蛋白质结晶领域，特别是干扰素类蛋白质结晶作用。人的α-干扰素是含有至少24个亚种的一族蛋白质，Zoon K.C，Interferon 91(1987)，Gresser I.，ed.AcademicPress，New York。它们最初被描述为能在细胞内诱发抗病毒态的试剂，但现在已知它们是影响免疫系统很多功能的多向性淋巴因子，Opdenakker，等人，Experimentia 45513(1989)。除了它们的体外生物活性外，近来人α-干扰素被用来治疗一些适应症，例如毛细胞性白血病，卡波济肉瘤，尖锐湿疣，乙肝和丙肝。α-2b干扰素是纯化无菌的，冻干的重组干扰素制剂。从结构的阐明以及各种剂型的制剂，包括开发控制释放制剂角度而言对高度纯化结晶形式α-干扰素，特别是重组型α-2b干扰素的需求是最为重要的。结晶人α-干扰素的两种形式已有报道，即由Miller等人，Science，215689(1982)；Kung等人，U.S.Patent No.4，672，108；Weissmann，The Cloning of Interferon andOther Mistakes，InInterferon 1981，Ian Gresser，ed.，Academic Press，New York，101～134；Weissmann，Phil.Trans.R.Soc.Lònd.B2997(1982)；Nagabhushan，等人，Characterization of genetically Engineered alpha-2Interferon′，InInterferonResearch Clinical Applicationand Regulatory Consideration，Zoon等人，Elsevier，NewYork 79(1982)报道。这些出版物描述了在低温下由聚乙二醇或通过调节pH或温度由磷酸盐缓冲液中结晶α-2-干扰素的方法。Miller等人的文章还指出结晶α-2干扰素是“棱柱形”的。在国际专利申请No.PCT/US 91/03660中公开了在22℃由蒸汽扩散悬滴实验从硫酸铵溶液中制备α-2b干扰素的单斜棱晶的条件。一般情况下，通常在医院或诊所，α-IFN或者通过皮下或者通过静脉内注射给药。当皮下注射时α-IFN的血清半衰期是2～6小时，当静脉内注射时其血清半衰期是几分钟，并且当随时间测定血液水平时，特征地显示“突发出现”或“脉冲”分布图形(即血清水平快速上升，接着血清水平快速清除)。因此该蛋白质经常性给药的剂量一定要保持该药的治疗有效血清浓度。有临床情况，当让该蛋白质连续释放到血液中使该蛋白质的血清浓度达到一坪值且在一段时间内保持该水平，可以在治疗上更有利于开发α-IFN制剂。这就是所谓的控制释放制剂。至今为止，已知的结晶α-IFN中没有一种具有可控药物传送系统所需要的性质，特别是适于注射的“一般被认为安全”(GRAS)类型制剂中的、37℃时限定的溶解度和稳定性。可控释放治疗有许多潜在的优点。主要地，可控释放药物能以较低有效剂量给药，提高了其安全性同时保持或提高了其效力。因为延长的生物利用度为增加的生物分布、加强组织和有机体渗透提供了机会，因此可发掘新的治疗适应症。因此需要一种α-IFN可控释放制剂。本专利技术概要本专利技术提供了单斜晶形态的结晶锌-α-2-干扰素(α-2-IFN)。本专利技术还提供了结晶钴-α-2-干扰素和当给灵长类皮下注射时，血清半衰期至少是大约12个小时的结晶α-2-干扰素。本专利技术进一步提供了一种制备结晶α-2-IFN的方法，包括生成可溶性金属-α-2-IFN配合物，在将使金属-α-2-IFN溶液变为过饱和并生成结晶金属-α-2-IFN的条件下，用一种该金属的乙酸盐平衡溶液中的可溶性金属-α-2-IFN配合物。本专利技术包括有单斜晶，片状和针状形态的结晶金属-α-IFN。附图的简要描述附图说明图1描述了磷酸盐缓冲液中α-2b干扰素的血清血液水平，曲线10，和结晶锌-α-2b干扰素的血清血液水平，借助硫酸鱼精蛋白赋形剂注射时与时间的函数关系，图12。本专利技术的详细描述本专利技术涉及α-干扰素的金属配合物的新的结晶形态。特别是，公开了锌和钴的结晶干扰素配合物。这些晶体具有用于药物传送系统中所需要的溶解性质，包括在37℃时限定的溶解度，颗粒范围＜200μm，以及室温下在适于注射的溶液中的稳定性。用34×106IU结晶锌-α-2b-IFN悬浮液进行单次皮下注射，与α-2b-IFN非结晶形INTRON A(Schering-Plough，Kenilworth New Jersey)的血清半衰期2～3小时相比，其测定的消除血清半衰期是12个小时，血清半衰期增长了4～6倍。可以用几种方法，例如如蒸汽扩散，液体扩散，恒温和温度诱导或其组合方法使金属-干扰素配合物的过饱和溶液诱发结晶。只在蛋白质浓度，缓冲液浓度，金属离子浓度和温度的窄范围条件下发生结晶作用。可通过在4°至22℃恒温下的蒸汽扩散(悬滴方法)，液体扩散(透析和超滤)或通过温度诱导方法(温度随时间由4℃升至22℃)得到这些设计的过饱和条件。优选地用来与α-2b干扰素配合的金属盐是钴盐或锌盐，且通过恒温或温度诱导实现平衡。金属-α-IFN配合物的溶液含有一种金属的乙酸盐。该金属的乙酸盐优选选自锌、镉、钾、锂、镁和钴盐，更优选的是乙酸锌。并且通过恒温的方法或者通过温度诱导方法使溶液诱发结晶。在蒸汽扩散和液体扩散实验中，溶液最好与更浓的乙酸锌或乙酸钴溶液平衡。平衡是指较低盐浓度溶液的溶剂渗透性地扩散到有较高盐浓度的另一溶液的溶液中，以使得两溶液中盐浓度达到平衡的过程。结晶开始形成时，存在于结晶α-2-IFN溶液中的乙酸盐的浓度优选为大约60mM至大约140mM，更优选乙酸盐浓度是大约80mM至大约100mM。如下文所述，蒸汽扩散或液体扩散实验时，平衡过程起始时乙酸盐的浓度较低，即为大约20mM至大约70mM。优选α-2-IFN是α-2b-干扰素，更优选的是人重组α-2b-干扰素。在一实施方案中，所用材料是具有序列ID NO1所示氨基酸序列的α-2b-干扰素。也可以使用α-2a-IFN。α-2a干扰素的初级氨基酸序列与上述α-2b-IFN序列不同，在23位残基上用赖氨酸取代了精氨酸。α-2-干扰素的乙酸盐溶液优选包括pH5.0至7.0，更优选pH5.5至6.5的缓冲液，如35mM乙酸钠，pH6.0的缓冲溶液。如上所述，本专利技术方法包括在所设计的产生过饱和结晶的条件下，制备金属-α-2-IFN可溶的配合物。用几种结晶方法，如恒温下蒸汽扩散，液体扩散和温度诱导或这些方法的组合能达到过饱和条件。在蒸汽扩散方法中，锌-α-2-IFN配合物与将使锌α-2-IFN溶液变为过饱和的并在恒温下生成α-2-干扰素晶体的乙酸盐溶液平衡。在液体扩散方法中，在恒温下，乙酸锌缓冲液中的锌-α-2-IFN配合物对较高浓度乙酸锌缓冲液透析。在温度诱导方法中，通过使温度由4℃升至22℃，使金属乙酸盐缓冲液中的金属-α-IFN溶液产生结晶。可以使用任何合适的α-2-IFN，例如α-2a-IFN和α-2b-IFN，更优选入重组α-2b-IFN(γ-h-α-2a-本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：P·赖赫特，C·麦尼马，N·纳加布山，T·L·纳加布山，S·廷多尔，A·卢扎，
申请(专利权)人：先灵公司，
类型：发明
国别省市：