一种棉花基因的编辑方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花基因的编辑方法。公开了用于棉花基因组编辑的CRISPR‑Cas9系统及其构建方法。本发明专利技术克隆得到两个陆地棉U6启动子pGhU6‑7和pGhU6‑9，并突变了Bsa Ⅰ酶切位点。利用优化后的启动子构建了在棉花中具有编辑能力的CRISPR‑Cas9载体的两个载体pRGEB32‑GhU6.7‑NPT Ⅱ、pRGEB32‑GhU6.9‑NPT Ⅱ。选取1个棉花内源基因GhCLA为目标基因，设计四个靶向该基因的sgRNA，引导Cas9蛋白在GhCLA的特异位点进行切割。通过棉花的白化表型、酶切图、测序验证，表明pGhU6‑7I和pGhU6‑9I驱动的CRISPR‑Cas9基因编辑系统在棉花内具有编辑能力。

An editing method of cotton gene

The invention belongs to the technical field of plant gene engineering, in particular to a cotton gene editing method. CRISPR Cas9 system for cotton genome editing and its construction method are disclosed. The present invention clones two promoter U6 pGhU6 7 and pGhU6 9 of upland cotton, and mutates Bsa I enzyme cleavage site. By using the optimized promoter, two carriers, pRGEB32 GhU6.7 NPT II and pRGEB32 GhU6.9 NPT II, which have edited ability in cotton, are constructed in cotton, which have editing ability in cotton. 1 cotton endogenous gene GhCLA was selected as the target gene, and four sgRNA targeting the gene was designed to guide the Cas9 protein to be cut at the specific site of GhCLA. By verifying the albino phenotype, enzyme digestion and sequencing of cotton, it was shown that the CRISPR Cas9 gene editing system, driven by pGhU6 7I and pGhU6 9I, had the ability to edit cotton.

【技术实现步骤摘要】
一种棉花基因的编辑方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种陆地棉基因组的编辑方法。本专利技术涉及构建陆地棉的两个高效转化载体，利用这两个载体在陆地棉基因组中进行编辑的应用。
技术介绍
基因突变是研究基因功能的常用方法之一，从EMS突变，辐射诱变，T-DNA插入，转座子插入等随机突变方法，到锌指核酸酶(ZFN)与类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)目标基因定点修饰技术，是生物
的一次突破。CRISPR是指一段具有成簇的规律间隔的短回文重复序列，通过CRISPR系统将目标序列切断后，生物个体会启动自身的修复机制，包括非同源重组修复和同源重组修复，在修复后产生插入、缺失等突变，导致目标基因功能沉默。CRISPR系统可以靶向任何含5’-N20-NGG-3’(N＝A，T，G，C)或5’-CCN-N20-3’的DNA序列，其中NGG为Cas9识别所需的PAM，并且在PAM前3bp左右的位置精确的切割靶DNA双链。CRISPR/Cas9技术使基因定点突变变得十分简单快捷、方便且具有较高的突变效率，使其成为了科研工作者首选的基因定点修饰的技术之一，越来越广泛地应用于动植物研究中。谢卡斌等(Xie,MinkenbergandYang2015)在水稻中已证实tRNA-gRNA重复序列在tRNA通过内源的RNaseP和RNaseZ修饰后释放多个gRNA。这一研究说明在植物中可以实现多基因多位点打靶，大大提高了CRISPR/Cas9系统用于基因组编辑的效率。不同的物种，U6启动子的启动转录的效率不同，同一个物种中的U6转录效果也不一样，而棉花中含有多个GhU6启动子，所以克隆适用于棉花基因编辑的GhU6启动子对CRISPR-Cas9系统高效是非常重要的。目前，已有许多关于CRISPR/Cas9系统应用在不同生物中的报道，但棉花作为重要的纤维作物，至今尚无报道。近几十年我国在转基因抗虫棉培育、现代分子育种体系的建立和棉花品种高效应用保障技术等方面取得成就的同时，也面临着许多新的难题。包括优异的种植资源匮乏；棉花枯、黄萎病逐年加重；抗虫棉的普及引起次生害虫的危害增加；盐渍化田地逐年增加等。因此，利用CRISPR基因编辑技术深入探讨基因功能，了解棉花抗逆、抗病、抗虫分子机理，对为棉花抗性育种提供理论依据和候选基因具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建适合于陆地棉CRISPR/Cas9基因的编辑系统。克隆了棉花内源启动子pGhU6，所述的启动子包括pGhU6-7、pGhU6-9，并进行了BsaⅠ酶切位点优化。基于pRGEB32载体(Xieetal.2015)，构建了适合陆地棉转化并具有高效编辑的载体，所述的包括pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ和pRGEB32-GhU6.9-NPTⅡ。本专利技术技术方案如下所述：一种陆地棉高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ，该载体通过下列步骤制备获得：(1)构建陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6-7I，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，具体地，该启动子通过以下步骤制备获得：1)通过与拟南芥U6-26snRNA基因同源比对得到多个陆地棉U6启动子，用Primer5软件设计引物；2)以陆地棉YZ1(Jinetal.2006)基因组DNA为模板，PCR扩增，然后用pGEM-TEasy克隆测序验证，将检测正确的启动子序列命名为pGhU6-7；3)利用重叠延伸PCR(Urban,NeukirchenandJaeger1997)将步骤2)中pGhU6-7第319个碱基C人工突变为碱基G，删除pGhU6-7启动子所含有的BsaⅠ位点，得到pGhU6-7I启动子(其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)；(2)利用SbfⅠ、HindⅢ对pRGEB32进行酶切，与pGhU6-7I启动子进行连接，得到如SEQIDNO：6所示的中间载体pRGEB32-GhU6.7；(3)利用Primer5软件对pHellsgate4载体上的真核NPTⅡ序列(其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示)设计引物，然后以pHellsgate4质粒为模板进行PCR扩增；(4)将pRGEB32载体(Xieetal.2015)用XmaⅠ、PspxⅠ酶切，然后将上述步骤(3)中的NPTⅡ序列(其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示)引入步骤(2)中的中间载体pRGEB32-GhU6.7，得到如SEQIDNO：8所示的陆地棉高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ。申请人同时制备了一种陆地棉高效转化载体pRGEB32-GhU6.9-NPTⅡ，该载体的制备步骤如下所述：(1)构建一种陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6-9I，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，该启动子通过以下步骤制备获得：1)通过与拟南芥U6-26snRNA基因同源比对得到多个陆地棉U6启动子，用Primer5软件进行设计引物；2)以陆地棉YZ1(Jinetal.2006)基因组DNA为模板，PCR扩增，然后用pGEM-TEasy克隆测序验证，得到启动子pGhU6-9，所述的pGhU6-9启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；3)利用重叠延伸PCR(Urbanetal.1997)将步骤2)中pGhU6-9启动子第616个碱基C人工突变为碱基G，删除pGhU6-9启动子所含有的的BsaⅠ位点，得到启动子pGhU6-9I(核苷酸序列如SEQIDNO：3所示)；(2)利用SbfⅠ、HindⅢ对pRGEB32进行酶切，与启动子pGhU6-9I连接，得到如SEQIDNO：7所示的中间载体pRGEB32-GhU6.9；(3)利用Primer5软件对pHellsgate4载体上的真核NPTⅡ序列(其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示)设计引物，然后以pHellsgate4质粒为模板进行PCR扩增；(4)将pRGEB32载体(Xieetal.2015)用XmaⅠ、PspxⅠ酶切，然后将上述(3)中的NPTⅡ序列(其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示)引入步骤(2)中的中间载体pRGEB32-GhU6.9中得到如SEQIDNO：9所示核苷酸序列的陆地棉高效转化载体pRGEB32-GhU6.9-NPTⅡ。附图说明序列表SEQIDNO：1是pGhU6-7I启动子的核苷酸序列。序列长度为988bp。序列表SEQIDNO：2是pGhU6-7启动子的核苷酸序列。序列长度为988bp。序列表SEQIDNO：3是pGhU6-9I启动子的核苷酸序列。序列长度为997bp。序列表SEQIDNO：4是pGhU6-9启动子的核苷酸序列。序列长度为997bp。序列表SEQIDNO：5是获得的起始载体pRGEB32的核苷酸序列。序列长度为15905bp。序列表SEQIDNO：6是中间载体pRGEB32-GhU6.7的核苷酸序列。序列长度为16516bp。序列表SEQIDNO：7是中间载体pRGEB32-GhU6.9的核苷酸序列。序列长度为16525bp。序列表SEQIDNO：8是高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ的核苷酸序列。序列长度为16241bp。序列表SEQIDNO：9是高效转化载体pRGEB32-GhU本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种陆地棉高效转化载体pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：(1)构建陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6‑7I，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过以下步骤制备得道：1)通过与拟南芥U6‑26snRNA基因同源比对得到陆地棉U6启动子，用Primer5软件设计引物；2)以陆地棉YZ1基因组DNA为模板，PCR扩增，然后用载体pGEM‑T Easy克隆测序验证，得到启动子pGhU6‑7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；3)利用重叠延伸PCR将步骤2)中所述的pGhU6‑7启动子的第319位的碱基C突变为碱基G，删除pGhU6‑7启动子所含有的BsaⅠ位点，得到pGhU6‑7I启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；(2)利用SbfⅠ、HindⅢ对载体pRGEB32进行酶切，与pGhU6‑7I启动子进行连接，得到如SEQ ID NO：6所示序列的中间载体pRGEB32‑GhU6.7；(3)利用Primer5软件对pHellsgate4载体上的真核NPTⅡ序列设计引物，所述的真核NPTⅡ序列核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，然后以pHellsgate4质粒为模板进行PCR扩增；(4)将pRGEB32载体用XmalⅠ、PspxⅠ酶切，然后将步骤(3)中的NPTⅡ序列引入步骤(2)中的中间载体pRGEB32‑GhU6.7，得到如SEQ ID NO：8所示的表达载体pRGEB32‑GhU6.7‑NPTⅡ。...

【技术特征摘要】
1.一种陆地棉高效转化载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：(1)构建陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6-7I，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，通过以下步骤制备得道：1)通过与拟南芥U6-26snRNA基因同源比对得到陆地棉U6启动子，用Primer5软件设计引物；2)以陆地棉YZ1基因组DNA为模板，PCR扩增，然后用载体pGEM-TEasy克隆测序验证，得到启动子pGhU6-7，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；3)利用重叠延伸PCR将步骤2)中所述的pGhU6-7启动子的第319位的碱基C突变为碱基G，删除pGhU6-7启动子所含有的BsaⅠ位点，得到pGhU6-7I启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；(2)利用SbfⅠ、HindⅢ对载体pRGEB32进行酶切，与pGhU6-7I启动子进行连接，得到如SEQIDNO：6所示序列的中间载体pRGEB32-GhU6.7；(3)利用Primer5软件对pHellsgate4载体上的真核NPTⅡ序列设计引物，所述的真核NPTⅡ序列核苷酸序列如SEQIDNO：10所示，然后以pHellsgate4质粒为模板进行PCR扩增；(4)将pRGEB32载体用XmalⅠ、PspxⅠ酶切，然后将步骤(3)中的NPTⅡ序列引入步骤(2)中的中间载体pRGEB32-GhU6.7，得到如SEQIDNO：8所示的表达载体pRGEB32-GhU6.7-NPTⅡ。2.一种陆地棉高效转化的载体pRGEB32-GhU6.9-NPTⅡ，其特征在于，该载体通过下列步骤制备获得：(1)构建陆地棉内源RNA聚合酶三型U6启动子pGhU6-9I，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，通过以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：金双侠，张献龙，张军，王鹏程，涂礼莉，梁思佳，孙琳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42