检测猪PRKAG1基因表达量的方法及应用技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，公开了一种检测猪PRKAG1基因表达量的方法，包括合成PRKAG1基因特异性引物对A‑F和A‑R以及内参基因引物对G‑F和G‑R；提取待测猪的骨骼肌细胞总RNA并反转录成cDNA，得到待测猪的细胞cDNA；以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对G‑F和G‑R为引物qPCR扩增猪GAPDH内参基因，以S1所述的引物对A‑F和A‑R为引物qPCR扩增猪PRKAG1基因；检测S3中qPCR的结果，计算表达量。本发明专利技术通过设计PRKAG1基因特异性引物对，参考内参引物GAPDH的qPCR扩增，以及对qPCR结果的相对定量分析，准确、快速地分析了该基因在实验组和对照组中的表达情况。本发明专利技术还提供了一种上述方法的应用。

【技术实现步骤摘要】
检测猪PRKAG1基因表达量的方法及应用
本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种检测猪PRKAG1基因表达量的方法及应用。
技术介绍
脂肪不仅是动物能量的主要来源，而且还与肉品的风味及食用价值有很大的关系。其中，猪肌内脂肪的含量是影响猪肉品质的一个重要因素，主要影响肉的嫩度、系水力、剪切力、风味和多汁性，因此阐明猪肌内脂肪沉积的机制，对改善肉食香味、提高猪肉的食用价值具有重要意义，是进行猪肌肉品质改良的重要基础。PRKAG1基因属于AMPK(AMP活化蛋白激酶)家族中的一员，编码AMPK复合物的r1亚基，肌肉中的AMPK激活，可导致葡萄糖转运子从细胞内转运至细胞浆膜上，促进肌肉对葡萄糖的吸收能力，从而提高骨骼肌中糖原含量，由于AMPK调节能量代谢和能量分配中的核心作用，编码亚基的基因被认为是调控家畜饲料利用效率和肉品质性状的主效基因。猪PRKAG1基因定位于SSC5，其附近存在有影响脂肪性状的QTL，研究发现AMPK可以调节宰后家畜肌肉的糖酵解速度，糖酵解又会对屠宰后家畜肌肉品质造成影响，决定肉的质量好坏。故而检测猪PRKAG1基因表达量对于研究屠宰后家畜肌肉品质具有重要影响，然而现有技术并没有针对猪PRKAG1基因的检测方法。
技术实现思路
本专利技术提供的一种检测猪PRKAG1基因表达量的方法及应用，灵敏度高、特异性好，可以快速、准确检测PRKAG1基因的表达量。本专利技术的目的是提供一种检测猪PRKAG1基因表达量的方法，包括以下步骤：S1，合成PRKAG1基因特异性引物对A-F和A-R以及内参基因引物对G-F和G-R：所述的引物对A-F和A-R的序列为：A-F:5’-CATCCTCAAGACACCCCA-3’，如SEQIDNO.1所示，A-R:5’-CACCAAAGCAAAGAAAGC-3’，如SEQIDNO.2所示，所述的引物对G-F和G-R的序列为：G-F：5’-ACACTCACTCTTCTACCTTTG-3’，如SEQIDNO.3所示，G-R：5’-CAAATTCATTGTCGTACCAG-3’，如SEQIDNO.4所示；S2，提取待测猪的骨骼肌细胞总RNA并反转录成cDNA，得到待测猪的细胞cDNA；S3，以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对G-F和G-R为引物，qPCR扩增内参基因GAPDH；以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对A-F和A-R为引物，qPCR扩增猪PRKAG1基因；S4，检测S3中qPCR的结果，计算表达量。优选的，上述检测猪PRKAG1基因表达量的方法，S2的步骤具体如下：包装猪MASTR基因重组腺病毒；将猪MASTR基因重组腺病毒感染猪骨骼肌细胞后提取猪骨骼肌细胞的RNA，并反转录成cDNA。优选的，上述检测猪PRKAG1基因表达量的方法，S3中，内参基因GAPDH的qPCR扩增反应体系为：ExTaqTMII10.0μL，ddH2O7.4μL，G-F0.8μL，G-R0.8μL，猪的细胞cDNA1.0μL；猪PRKAG1基因qPCR扩增反应体系为：ExTaqTMII10.0μL，ddH2O7.4μL，A-F0.8μL，A-R0.8μL，猪的细胞cDNA1.0μL；其中，G-F、G-R、A-F和A-R的浓度均为10μmol/L，猪的细胞cDNA的浓度为800ng/μL；内参基因GAPDH和猪PRKAG1基因的qPCR扩增反应程序相同，均为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸20s，40个循环。本专利技术的另一个目的是提供一种上述方法中述及的引物对A-F和A-R以及引物对G-F和G-R在制备PRKAG1基因检测试剂盒中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供一种检测猪PRKAG1基因表达量的方法，具有以下有益效果：本专利技术通过设计PRKAG1基因特异性引物对，内参引物GAPDH的qPCR扩增，以及对qPCR结果的相对定量分析，准确、快速地分析了该基因在不同品种猪不同组织中的表达情况。我们所建立的检测PRKAG1基因表达水平的Q-PCR检测方法，可用于检测PRKAG1基因的表达水平，对深入研究猪PRKAG1基因功能提供参考，且方法简便，易操作。本专利技术方法中述及的引物对A-F和A-R和引物对G-F和G-R在制备PRKAG1基因检测试剂盒中的应用，弥补了猪PRKAG1基因表达量检测的空白。另外，我们采用ChIP-seq技术对猪Myocardin转录因子家族中的MASTR转录因子的下游靶基因进行了研究，结果发现PRKAG1基因是其潜在的靶基因，故而在转染猪MASTR基因重组腺病毒后检测PRKAG1基因，准确率更高。附图说明图1为不同腺病毒感染猪骨骼肌细胞后的荧光观察图(4×)；其中图1A、图1B和图1C分别为Ad-MASTR、Ad-GFP、空白对照组感染后的猪骨骼肌细胞；图2为Ad-MASTR感染后MASTR基因的Q-PCR检测结果；其中blank为空白对照，vector为阴性对照，OE为目的病毒Ad-MASTR；图3为Ad-MASTR感染后MASTR基因的Western-Blot检测结果；其中空白为空白对照，Ad-GFP为阴性对照，Ad-mastr为Ad-MASTR；图4是PRKAG1基因的qPCR熔解曲线；图5是Ad-MASTR转染后的PRKAG1基因表达量结果；其中Ad-MASTR表示目的基因PRKAG1；Ad-Control表示阴性对照。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术提供的一种检测猪PRKAG1基因表达量的方法，包括以下步骤：S1，合成PRKAG1基因特异性引物对A-F和A-R以及内参基因引物对G-F和G-R：所述的引物对A-F和A-R的序列为：A-F:5’-CATCCTCAAGACACCCCA-3’，如SEQIDNO.1所示，A-R:5’-CACCAAAGCAAAGAAAGC-3’，如SEQIDNO.2所示，所述的引物对G-F和G-R的序列为：G-F：5’-ACACTCACTCTTCTACCTTTG-3’，如SEQIDNO.3所示，G-R：5’-CAAATTCATTGTCGTACCAG-3’，如SEQIDNO.4所示；S2，提取待测猪的骨骼肌细胞总RNA并反转录成细胞cDNA，得到待测猪的细胞cDNA；S3，以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对G-F和G-R为引物，qPCR扩增内参基因GAPDH；以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对A-F和A-R为引物，qPCR扩增猪PRKAG1基因；S4，检测S3中qPCR的结果，计算表达量。下面以上游基因MASTR基因腺病毒转染后为例，说明PRKAG1基因的表达量变化水平的检测方法。实施例1(1)包装猪MASTR基因重组腺病毒按照常规方法制备含有MASTR基因的重组腺病毒载体质粒MASTR；通过菌液大量扩增培养并且提取重组腺病毒载体质粒MASTR(2μg)及骨架质粒pHBAd-BHG(4μg)，保存备用。培养人胚肾细胞系HEK293细胞至70-80％的密度时，取重组腺病毒载体质粒M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪PRKAG1基因表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，合成PRKAG1基因特异性引物对A‑F和A‑R以及内参基因引物对G‑F和G‑R：所述的引物对A‑F和A‑R的序列为：A‑F:5’‑CATCCTCAAGACACCCCA‑3’，如SEQ ID NO.1所示，A‑R:5’‑CACCAAAGCAAAGAAAGC‑3’，如SEQ ID NO.2所示，所述的引物对G‑F和G‑R的序列为：G‑F：5’‑ACACTCACTCTTCTACCTTTG‑3’，如SEQ ID NO.3所示，G‑R：5’‑CAAATTCATTGTCGTACCAG‑3’，如SEQ ID NO.4所示；S2，提取待测猪的骨骼肌细胞总RNA并反转录成cDNA，得到待测猪的细胞cDNA；S3，以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对G‑F和G‑R为引物，qPCR扩增内参基因GAPDH；以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对A‑F和A‑R为引物，qPCR扩增猪PRKAG1基因；S4，检测S3中qPCR的结果，计算表达量。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪PRKAG1基因表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，合成PRKAG1基因特异性引物对A-F和A-R以及内参基因引物对G-F和G-R：所述的引物对A-F和A-R的序列为：A-F:5’-CATCCTCAAGACACCCCA-3’，如SEQIDNO.1所示，A-R:5’-CACCAAAGCAAAGAAAGC-3’，如SEQIDNO.2所示，所述的引物对G-F和G-R的序列为：G-F：5’-ACACTCACTCTTCTACCTTTG-3’，如SEQIDNO.3所示，G-R：5’-CAAATTCATTGTCGTACCAG-3’，如SEQIDNO.4所示；S2，提取待测猪的骨骼肌细胞总RNA并反转录成cDNA，得到待测猪的细胞cDNA；S3，以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对G-F和G-R为引物，qPCR扩增内参基因GAPDH；以待测猪的细胞cDNA为模板，以S1所述的引物对A-F和A-R为引物，qPCR扩增猪PRKAG1基因；S4，检测S3中qPCR的结果，计算表达量。2.根据权利要求1所述的检测猪PRKAG1基因表达量的方法，其特征在于，S...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩雪蕾，郭林林，王春秀，秦锐峰，吕刚，乔瑞敏，李新建，林峰，任广志，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41