一种孕烷X受体转基因小鼠模型、其构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种人孕烷X受体转基因小鼠模型，它是由人PXR转基因鼠与鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR‑KO交配繁殖得到的小鼠；所述的人PXR转基因鼠是转入了含人孕烷X受体全基因序列的细菌人工染色体片段的小鼠。本发明专利技术还提供构建所述人孕烷X受体转基因小鼠模型的方法。本发明专利技术繁育出的孕烷X受体转基因小鼠表达人PXR主要的剪接变异体，表达水平接近生理水平，对人PXR特异性激活剂有应答，可以用于工业原料化学品、小分子化学药、农药等化学物是否人PXR激活剂/减活性剂的快速筛选和体内验证，有广泛的应用前景。

A model of pregnant X receptor transgenic mice, its construction method and Application

The present invention provides a transgenic mouse model of the human pregnancy alkane X receptor, which is produced by the mating and reproduction of the human PXR transgenic mice and the mouse gestational alkanes X receptor knockout mouse KO. The human PXR transgenic mice are transformed into the mice of the bacterial artificial chromosome fragment containing the whole gene sequence of the human pregnancy alkane X receptor. The invention also provides a method for constructing the transgenic mouse model of human pregnancy X receptor. The pregnant alkane X receptor transgenic mice expressed the main splice variants of human PXR, the expression level was close to the physiological level, and it responded to the human PXR specific activator. It could be used for the rapid screening and in vivo validation of industrial raw materials chemicals, small molecular chemicals, pesticides and other chemicals, such as PXR activator / deactivator. It has a wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种孕烷X受体转基因小鼠模型、其构建方法及其应用
本专利技术涉及一种孕烷X受体转基因小鼠模型，以及所述模型的构建方法及其应用，属于生物化学领域。
技术介绍
孕烷X受体(PregnaneXReceptor,PXR)是属于核受体超家族的一种受体蛋白，按核受体系统命名为NR1I2，与组成型雄烷受体(ConstitutiveAndrostaneReceptor,CAR)构成机体对环境外源性化学物的主要感受器。人孕烷X受体(hPXR)基因鉴定于1998年，在各器官广泛表达，尤其在肝脏、肠组织中高表达。目前已知的PXR生物效应包括：调节代谢酶和转运蛋白基因表达水平；能量代谢调节；内源代谢物及内分泌激素表达水平调节；炎症反应调节等。基于上述重要作用，2007年美国国家研究委员会(NRC)发表的《二十一世纪毒性测试：策略及展望》中，PXR活化作用被列为体外测试毒性途径之一。在药物研发、化学品毒性检测中，需要对化学物是否影响PXR活性进行筛选。国内外已构建的hPXR转基因小鼠仅导入外显子基因序列，不能表达hPXR的剪接变异体，其基因上下游的调控序列未同时导入。因此，构建一种导入hPXR基因全长序列的转基因小鼠具有更多的人源特性和应用前景。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种导入hPXR基因全长序列的转基因小鼠模型，可表达hPXR主要的剪接变异体，表达水平接近生理水平，对hPXR特异性激活剂有特异性应答。本专利技术的另一个目的是提供构建所述转基因小鼠模型的方法。本专利技术的再一个目的是提供所述转基因小鼠模型在hPXR激活剂/减活性剂的快速筛选或体内验证中的应用。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：首先，提供一种人孕烷X受体转基因小鼠模型，它是由人PXR转基因鼠与鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO交配繁殖得到的小鼠；其中，所述的人PXR转基因鼠是转入了含人孕烷X受体全基因序列的细菌人工染色体片段的小鼠。本专利技术所述的人孕烷X受体转基因小鼠模型不表达鼠源PXR，仅表达人源PXR。本专利技术还提供一种构建所述人孕烷X受体转基因小鼠模型的方法，包括：构建鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO，以含人孕烷X受体全基因序列的细菌人工染色体片段构建人PXR转基因鼠，用所述鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO与所述人PXR转基因鼠种进行交配繁殖，得到所述的人孕烷X受体转基因小鼠模型。本专利技术优选的所述构建方法中，所述的构建鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO应用CRISPR-Cas9技术实现。本专利技术优选的所述构建方法中，所述的含人孕烷X受体全基因序列的细菌人工染色体片段为RP11-937I6细菌人工染色体片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术优选的所述构建方法中，所使用的鼠的品系优选C57BL/6J，其基因组PXR序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术最优选的所述构建方法，具体包括如下步骤：1)应用CRISPR-Cas9技术构建鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO；2)将RP11-937I6细菌人工染色体片段(其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)注射到C57BL/6J小鼠受精卵的原核中，将处理后的所述受精卵移植入代孕母鼠中发育，出生后得到F0代嵌合体小鼠；3)将2)中获得的所述F0代嵌合体小鼠与1)中得到的PXR-KO小鼠进行杂交得到F1代小鼠，从F1代小鼠中获得转入了所述RP11-937I6细菌人工染色体片段的杂合体小鼠，即为hPXR转基因鼠。进一步优选的构建方法中，步骤1)、步骤2)和步骤3)分别进一步包含通过PCR扩增及对PCR扩增DNA产物进行测序来选择阳性基因型小鼠。本专利技术还提供所述孕烷X受体转基因小鼠模型在人孕烷X受体激活剂或减活性剂的快速筛选或体内验证中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术繁育出的孕烷X受体转基因小鼠表达hPXR主要的剪接变异体，表达水平接近生理水平，对hPXR特异性激活剂有特异性应答。所以，可以用于工业原料化学品、小分子化学药、农药等化学物是否为hPXR激活剂/减活性剂的快速筛选和体内验证，具有广泛的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例中步骤1.5所述序列在小鼠Nr1i2基因组中的位置示意图。图2体现了应用本专利技术实施例方法构建的小鼠PXR剪接变异体丰度。图3体现了应用本专利技术实施例方法构建的小鼠PXR表达水平。图4和图5均体现了应用本专利技术实施例方法构建小鼠对种属特异性激活剂的应答。具体实施方式下面通过实施例结合附图进一步说明本专利技术。本专利技术建立了不表达鼠源PXR，仅表达人源PXR的小鼠，其表达hPXR主要的剪接变异体，表达水平接近生理水平，对hPXR特异性激活剂有特异性应答。实施例构建人PXR转基因小鼠及其化学物PXR激活作用鉴别应用：1.应用CRISPR-Cas9技术构建鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO；1.1.构建CRISPRKo-Cas9打靶载体：根据C57BL/6J鼠基因组PXR序列(SEQIDNO.1)设计gRNA打靶位点，并分别构建成CRISPRKo-Cas9打靶载体：gRNA1:5’-GACGCTCTACTTTAAGGTCA-3’(SEQIDNO.3)gRNA2:5’-TCCCAGGGTTTCTAGTAGTC-3’(SEQIDNO.4)1.2.CRISPR-Cas9基因敲除受精卵制备：通过体外转录将Cas9mRNA和gRNA质粒人工注射到小鼠受精卵中，并将受精卵回输到代孕鼠子宫；1.3.代孕并获得阳性建系鼠：代孕鼠生育小鼠后，剪取部分鼠尾通过PCR扩增并对扩增产物做DNA测序来选择阳性基因型小鼠；1.4.繁育后代：对后代小鼠基因型的分析依旧通过PCR扩增并对扩增产物做DNA测序来确定。1.4.1.F0代获得两只阳性且都为雄性的建系鼠，分别记为F0Mouse-ID#18,F0Mouse-ID#24；1.4.2.将F0建系雄鼠分别与雌性野生型C57BL/6J小鼠杂交【C57BL/6(Mouse-ID#18)×C57BL/6(WT)；C57BL/6(Mouse-ID#24)×C57BL/6(WT)】获得F1代小鼠，经鼠尾DNAPCR扩增并测序鉴定基因型各获得以下两种小鼠，分别记为：F0Mouse-ID#18-F1-Mouse-ID#2,#3,#4和F0Mouse-ID#24-F1-Mouse-ID#12,#17,#18；1.4.3.F1代小鼠单个品系组内杂交获得纯合的Nr1i2基因敲除小鼠；1.4.4.F1代经PCR产物DNA测序鉴定F0Mouse-ID#18-F1-Mouse-ID#2,#3,#4单链中有999碱基缺失，而F0Mouse-ID#24-F1-Mouse-ID#12,#17,#18单链中则有1038碱基缺失；1.5.本构建步骤中设计PCR引物、DNA测序引物、gRNA靶点序列信息如下：PCR引物MouseNr1i2-F:5’-GAGAGCAAAGCATTCAGGGTACAGATT-3(SEQIDNO.5)PCR引物MouseNr1i2-R:5’-GCACTGGGAGCAAAGACAGAGCTAG-3’(SEQIDNO.6)gRNA靶点序列1:5’-GACGCTCTACTTTAAGGTCA-3’(SEQIDNO.3)gRNA靶点序列2:5’-TCCCAGGGTTTCTAGTAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人孕烷X受体转基因小鼠模型，它是由人PXR转基因鼠与鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR‑KO交配繁殖得到的小鼠；所述的人PXR转基因鼠是转入了含人孕烷X受体全基因序列的细菌人工染色体片段的小鼠。

【技术特征摘要】
1.一种人孕烷X受体转基因小鼠模型，它是由人PXR转基因鼠与鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO交配繁殖得到的小鼠；所述的人PXR转基因鼠是转入了含人孕烷X受体全基因序列的细菌人工染色体片段的小鼠。2.一种构建人孕烷X受体转基因小鼠模型的方法，包括：构建鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO，以含人孕烷X受体全基因序列的细菌人工染色体片段构建人PXR转基因鼠，用所述鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO与所述人PXR转基因鼠种进行交配繁殖，得到所述的人孕烷X受体转基因小鼠模型。3.权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的构建鼠孕烷X受体敲除小鼠PXR-KO应用CRISPR-Cas9技术实现。4.权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的含人孕烷X受体全基因序列的细菌人工染色体片段为RP11-937I6细菌人工染色体片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.权利要求2所述的方法，其特征在于：所使用的鼠的品系为C57BL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海山，艾文超，沈国林，崔媛，谢文平，魏长垒，赵永雷，陈会明，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11