一种检测氟苯尼考的免疫学试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测氟苯尼考的免疫学试剂盒。本发明专利技术首先以氟苯尼考衍生物与载体蛋白的偶联物为氟苯尼考完全抗原，然后免疫骆驼科动物制备了氟苯尼考免疫检测抗体。本发明专利技术制备获得的高亲和力的氟苯尼考骆驼科动物抗体，氟苯尼考的羊驼多克隆抗体为1:32000，氟苯尼考的双峰驼多克隆抗体效价为1:256000；可研究开发出氟苯尼考酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒对氟苯尼考检测限为0.3 ng/mL，半数抑制浓度为13.3 ng/mL，能够实现氟苯尼考的高通量、快速、灵高敏的检测要求。该试剂盒可用于畜禽、水产品等动物性食品中氟苯尼考的残留检测，操作简便、灵敏度高、价格低廉，非常适合大量样品的筛查，具有广泛的应用前景。 1

An immunological kit for the detection of Florfenicol

The invention discloses an immunological kit for detecting florfenicol. The present invention first uses the coupling of florfenicol derivative and carrier protein as the complete antigen of florfenicol, and then immunize camel family to prepare the fluorfenicol immunoassay antibody. The present invention has prepared the high affinity florfenicol camelid antibody, the florfenicol Alpaca polyclonal antibody is 1:32000, the florfenicol polyclonal antibody titer of the Bactrian camel is 1:256000, and the florfenicol linked immunoassay kit can be developed. The kit is limited to 0.3 ng/mL, half of the florfenicol test. The inhibitory concentration of 13.3 ng/mL was able to achieve high throughput, rapid and Gao Min detection of florfenicol. The kit can be used to detect the residue of florfenicol in animal and aquatic products such as livestock and poultry and aquatic products. It is easy to operate, high sensitivity and low in price. It is very suitable for screening a large number of samples and has a wide application prospect. One

【技术实现步骤摘要】
一种检测氟苯尼考的免疫学试剂盒
本专利技术涉及食品安全免疫检测
检测
，更具体地，涉及一种检测氟苯尼考的免疫学试剂盒。
技术介绍
自农业部2002年193号公告明确规定氯霉素禁用于所有食品动物，目前氟苯尼考已成为氯霉素禁用后的主要替代品。氟苯尼考的杀菌力强、使用之后耐药率低，被广泛应用于畜禽和水产动物的细菌性疾病，具有良好的治疗效果。但是，随着氟苯尼考的大量、不规范使用，它在畜禽、水产品等动物性食品中的残留问题也日益被重视。目前，检测动物性食品中的氟苯尼考的主要方法为仪器法，虽然仪器残留检测已经可以实现对氟苯尼考的检测，但所需仪器复杂昂贵，而且样品前处理繁琐费时，操作需专业人员、检测费用高，很难适应现场快速检测的需要。为了实现氟苯尼考的高通量、快速、灵敏检测要求，研究开发针对氟苯尼考的酶联免疫检测试剂盒十分迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，用氟苯尼考衍生物与载体蛋白的偶联物作为氟苯尼考完全抗原免疫骆驼科动物，制备获得高亲和力的氟苯尼考骆驼科抗体，并利用次抗体制备用于检测氟苯尼考的免疫学试剂盒。本专利技术的第一个目的是提供一种氟苯尼考完全抗原。本专利技术的第二个目的是提供一种氟苯尼考的骆驼科动物抗体。本专利技术的第三个目的是提供所述的骆驼科动物抗体在检测氟苯尼考和制备检测氟苯尼考的免疫学试剂盒中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种检测氟苯尼考的免疫学试剂盒。本专利技术的第五个目的是提供所述的免疫学试剂盒在检测氟苯尼考的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种氟苯尼考完全抗原是氟苯尼考衍生物与载体蛋白的偶联物；所述氟苯尼考衍生物的结构如下：优选地，所述氟苯尼考完全抗原，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵白蛋白(OVA)。一种氟苯尼考的抗体，所述抗体为所述氟苯尼考完全抗原免疫骆驼科动物制备得到。优选地，骆驼科动物为羊驼、双峰驼或单峰驼。优选地，所述的抗体的制备方法为：S1.用权利要求1或2所述氟苯尼考完全抗原免疫羊驼；S2.然后分别在第22、36、50、64天各加强免疫一次；S3.在第71天，采集全血，收集纯化氟苯尼考羊驼多克隆抗体。更优选地，步骤S1中氟苯尼考完全抗原的用量为750μg；步骤S2中氟苯尼考完全抗原的用量为500μg优选地，所述的抗体的制备方法为：S1.用权利要求1或2所述氟苯尼考完全抗原免疫双峰驼；S2.然后分别在第15、29、43、57、71天各加强免疫一次；S3.在第78天，采集全血，收集纯化氟苯尼考双峰驼多克隆抗体。更优选地，步骤S1中氟苯尼考完全抗原的用量为500μg；步骤S2中氟苯尼考完全抗原的用量为500μg。所述的抗体在检测氟苯尼考或制备检测氟苯尼考的免疫学试剂盒中的应用，也属于本专利技术的保护范围。一种检测氟苯尼考的免疫学试剂盒，含有所述抗体，也属于本专利技术的保护范围。优选地，所述的免疫试剂盒，还包含有：包被有所述氟苯尼考完全抗原的酶标板，辣根过氧化物酶标记的二抗，氟苯尼考标准溶液，底物液，底物缓冲液，终止液，浓缩洗涤液。所述的免疫学试剂盒在检测氟苯尼考的应用，也属于本专利技术的保护范围。优选地，载体蛋白为鸡卵白蛋白。优选地，辣根过氧化物酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标记的抗骆驼科的二抗。优选地，所述酶标板是聚苯乙烯96孔或40孔酶标板。优选地，酶标板材质为聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、纤维素、玻璃的一种。优选地，所用的包被液是pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液。优选地，所述的氟苯尼考标准溶液浓度为1mg/mL，使用时用0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释成梯度氟苯尼考溶液(1000ng/mL、250ng/mL、62.5ng/mL、15.625ng/mL、3.90625ng/mL、0.97656ng/mL、0.24414ng/mL、0ng/mL)。优选地，所述的底物液为过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液。优选地，所述底物缓冲液为含有3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液。优选地，所述的终止液为5％～10％硫酸或2mol/L氢氧化钠溶液。优选地，所述的浓缩洗涤液为含有0.5％～1.0％吐温20的0.01mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液。所述的浓缩洗涤液使用时用去离子水稀释10-20倍。优选地，所述底物液为5～7％过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述底物缓冲液为含有3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液。优选地，所述终止液为10％硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为含有1.0％吐温20和0.1mol/mL磷酸盐缓冲液。本专利技术所述的包被有氟苯尼考完全抗原的酶标板的制备方法为：用包被液将氟苯尼考完全抗原稀释至一定浓度，向酶标板中加入稀释液，放入4℃或37℃环境中过夜孵育，倾去包被液，用洗涤液洗涤，然后向每孔中加入封闭液，4℃或37℃环境中孵育，倾去封闭液，干燥后使用铝膜真空包装袋保存。本专利技术还提供了所述氟苯尼考酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括下列步骤：(1)将试剂盒从冷藏环境在取出，置于室温条件下平衡；(2)将氟苯尼考标准品溶液或经前处理的待测样品溶液加入试剂盒的酶标板微孔中，然后每孔加入所述骆驼科动物抗体，轻微震荡混匀，37℃环境中孵育；(3)用洗涤液对酶标板微孔进行洗涤，拍干；(4)每孔加入辣根过氧化物酶标记的二抗，轻微震荡混匀，37℃环境中孵育；(5)用洗涤液对酶标板微孔进行洗涤，拍干；(6)将底物液和底物缓冲液等体积混合后得到酶联免疫检测显色液，向每孔中加入显色液，轻微震荡混匀，37℃环境中孵育；(7)每孔加入终止液，轻微震荡混匀，在450nm波长下用酶标仪测定酶标板微孔的吸光值；(8)以各标准品浓度孔吸光值与零标准孔吸光值比值为纵坐标，以药物标准液浓度的log10值为横坐标，绘制标准曲线图，从而根据待测样品的吸光值来计算样品中氟苯尼考的含量。抑制率按下式计算：其中各标准液浓度孔的吸光值为B，零标准孔的吸光值为B0。根据建立的标准曲线计算出检测限LOD(10％抑制率的药物浓度，IC10)和半数抑制量(50％抑制率的药物浓度，IC50)。本专利技术的氟苯尼考酶联免疫检测试剂盒依据如下检测原理：首先将包被抗原包被于固相载体(酶标板)上，然后加入氟苯尼考标准品或待测样品，再加入氟苯尼考骆驼科动物抗体，包被抗原与待测样品中的氟苯尼考竞争抗体，待测样品氟苯尼考含量高时，则与固相抗原结合的抗体就少，反之结合在固相抗原上的抗体就多，反应后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行反应，然后再加入显色液进行显色并加以测定。当氟苯尼考骆驼科抗体量一定时，加入的待测样品含氟苯尼考越多，与固相抗原结合的抗体就越少，发光反应减弱，抑制率增高，反之，则发光反应增强，抑制率减低，因而根据抑制率与氟苯尼考浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，再根据氟苯尼考的标准曲线和待检样品的抑制率，即可推算出待测样品中氟苯尼考的浓度。所述的免疫学试剂盒在检测氟苯尼考的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术以氟苯尼考衍生物与载体蛋白的偶联物为氟苯尼考完全抗原，制备氟苯尼考免疫检测骆驼科动物抗体，从而构建免疫检测方法和试剂盒，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氟苯尼考完全抗原，其特征在于，是氟苯尼考衍生物与载体蛋白的偶联物；所述

【技术特征摘要】
1.一种氟苯尼考完全抗原，其特征在于，是氟苯尼考衍生物与载体蛋白的偶联物；所述氟苯尼考衍生物的结构如下：。2.根据权利要求1所述氟苯尼考完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。3.一种氟苯尼考的抗体，其特征在于，所述抗体为权利要求1所述氟苯尼考完全抗原免疫骆驼科动物制备得到。4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，骆驼科动物为羊驼、双峰驼或单峰驼。5.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，其制备方法为：S1.用权利要求1或2所述氟苯尼考完全抗原免疫羊驼；S2.然后分别在第22、36、50、64天各加强免疫一次；S3.在第71天，采集全血，收集纯化氟苯尼考羊驼多克隆抗体。6.根据权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弘，王锋，沈玉栋，张瑾如，杨金易，李然，梁一凡，肖治理，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44