一种大视场高分辨三维衍射层析显微成像方法技术

技术编号:18235091 阅读:244 留言:0更新日期:2018-06-16 22:53
本发明专利技术公开了一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法,首先进行原始强度图像采集,根据LED阵列中每颗LED在空间中的坐标位置计算出在照明系统中每个LED灯对应的入射光的空间频率,然后初始化被测物体的大视场高分辨三维频谱,且该初始化矩阵满足每个方向上的最小采样数与最终的成像分辨率要求,并将每个照明角度下所拍摄的强度图像迭代至初始化的三维频谱中,并进行多轮迭代,迭代得出被测物体的三维频谱,并将该三维频谱变换至空域,最终得到被测的三维物体大视场高分辨的折射率信息分布。本发明专利技术无须采用高放大倍率的物镜,在保证较大的成像视场前提下也可达到较高的重构分辨率。 1

【技术实现步骤摘要】
一种大视场高分辨三维衍射层析显微成像方法
本专利技术属于光学显微测量、三维折射率成像技术,特别是一种基于LED阵列的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法。
技术介绍
大部分活细胞和未染色的生物标本都是无色透明的,这是因为细胞内各部份细微结构的折射率和厚度的不同,当光波通过时,波长和振幅并不发生变化,仅相位发生变化,这种相位差人眼无法观察。这就需要通过一些化学或者生物手段来对细胞进行染色,从而使其在显微镜下可见。由于生物细胞内部不同物质对有色染料吸收的吸收率不同,故最终在显微镜下就可以看见生物细胞内部的结构和表现出不同的生物特性(龚志锦,詹熔洲.病理组织制片和染色技术[M].上海科学技术出版社,1994)。但由于这种染色手段会对细胞和组织的正常生理活动造成影响,更有可能会杀死细胞。所以通过光学调控对生物样品的无标记观测手段应运而生,其中,泽尼克相衬成像和微分干涉相衬成像作为传统的无标记成像手段,通过将生物组织的相位延迟转化为强度信息,从而使未染色的细胞和生物组织在镜下可见。此外,待测物体的定量相位信息或者由折射率分布不均引起的光程差可利用干涉的方法来获取,利用干涉成像手段来获取定量相位信息的的典型方法为数字全息显微镜(DigitalHolographyMicroscopy,DHM),但这类成像方法需要激光光源和复杂的干涉光路,且对环境的振动较为敏感,不利于成像质量的提升(M.K.Kim,DigitalHolographicMicroscopy,Springer,NewYork2011)。计算层析成像(ComputedTomography,CT)作为生物医学领域常用的成像手段之一,利用X射线和不同入射角度下的生物组织对X射线的不同吸收率来重构出物体的三维结构信息(BeerlinkA,MellM,TolkiehnM,etal.Hardx-rayphasecontrastimagingofblacklipidmembranes[J].AppliedPhysicsLetters,2009,95(20):203703-203703-3)。当入射光波长变短至可见光波段的时候,被探测物体与入射光波会发生衍射现象,所以必须利用另一种成像模型来重构生物组织的三维分布。传统的光学衍射层析成像是通过改变干涉系统中物光的入射光波与参考光之间的夹角,从而可以得到每个入射光角度下物体相位分布,最终对生物物体三维折射率分布进行重构。Choi.W等人在2007年提出了衍射层析相位显微镜(ChoiW,Fang-YenC,BadizadeganK,etal.Tomographicphasemicroscopy[J].NatureMethods,2007,4(9):717-719),该成像方法是将振镜引入马赫曾德离轴全息的干涉系统中,入射光从各个方向扫描样片,重构出了未染色生物细胞和线虫(C.elegans)的三维折射率分布。2009年Sung.Y等人又将基于全息干涉和振镜旋转的方法用于活细胞的动态观察中(Sung,Y.,Choi,W.,Fang-Yen,C.,Badizadegan,K.,Dasari,R.R.,&Feld,M.S.Opticaldiffractiontomographyforhighresolutionlivecellimaging[J].Opticsexpress,2009,17(1),266-277.)。传统三维折射率层析成像方法利用干涉的方法需先获取在每个入射方向上的散射复振幅分布,该方法不仅需要复杂的干涉系统,而且振镜的机械转动也会影响最终的三维重构效果。南京理工大学智能计算成像实验室在2017年提出了一种利用LED照明和光强传输方程的非干涉的三维衍射层析成像方法(LiJ,ChenQ,ZhangJ,etal.Opticaldiffractiontomographymicroscopywithtransportofintensityequationusingalight-emittingdiodearray[J].Optics&LasersinEngineering,2017,95:26-34.),该方法通过拍摄在两个或多个不同焦面上的不同角度强度图像堆栈,再利用基于光强传输方程的相位解法直接求解出在不同入射光方向下的相位分布,最终重构出待测样品的三维折射分布。但是,上述所有三维衍射层析成像方法拍摄的强度图像均为明场图像,即照明数值孔径小与或等于物镜数值孔径NAill≤NAobj,而一些物体高频信息的散射光且没有被充分利用。所以如何将傅里叶衍射层析定理和傅里叶叠层成像技术有机结合,利用低倍物镜的大视场成像和由增大照明角度提升分辨率的方法来同时兼顾大视场和高分辨的三维折射率衍射层析成像是一个亟待解决的一个技术难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法,不仅无须干涉,简化了成像系统光路,而且可高度兼容传统明场显微镜,通过在低倍物镜下增大照明角度就解决了传统三维折射率衍射层析成像高分辨率和大视场不能同时兼顾的技术难题。实现本专利技术目的的技术方案为:一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法,步骤如下:步骤一,原始强度图像采集,将LED光源作为传统显微镜的照明光源,LED面板上的每颗LED依次被点亮,入射光经过聚光镜后从各个不同的入射角下照射样品,并且在被测的厚样品为聚焦情况下,由相机在同步触发信号下采集一系列不同照明角度下的强度图像其中某一个位置下采集的光强为步骤二,根据LED阵列中每颗LED在空间中的坐标位置计算出在照明系统中每个LED灯对应的入射光的空间频率kin=(kx,ky);步骤三,初始化被测物体的大视场高分辨三维频谱三维频谱矩阵像素个数分别为Nx,Ny,Nz,且该初始化矩阵满足每个方向上的最小采样数与最终的成像分辨率要求;步骤四,三维频谱迭代重构,将每个照明角度下所拍摄的强度图像迭代至初始化的三维频谱中,并进行多轮迭代;步骤五,迭代得出被测物体的三维频谱,并将该三维频谱变换至空域,最终得到被测的三维物体大视场高分辨的折射率信息分布n(r)。本专利技术与现有技术相比,其显著优点:(1)采用LED阵列作为该显微成像方法的照明光源,且与聚光镜有机组合,这样既保证了照明方向的编程可控,同时也保证了照明数值孔径最高可达到传统阿贝聚光镜的最大值1.20。(2)图像采集过程中不需要机械移动或振镜转动,仅由LED阵列的编程来实现照明光角度的改变。(3)所采集的强度图像中不仅有明场强度图像,还有包含高频衍射信息的暗场强度图像,将暗场图像迭代至三维频谱中,提高了三维成像的轴向分辨率与横向分辨率。(4)无须采用高放大倍率的物镜,在保证较大的成像视场前提下也可达到较高的重构分辨率。下面结合附图对本专利技术作进一步详细描述。附图说明图1是单颗LED产生入射光线与实际装置示意图。图2是本专利技术基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法的流程图。图3是三维傅里叶衍射层析定理示意图。图4是明场和暗场情况下不同方向的入射光在三维频谱上对应的位置。图5是最终重构之后的三维频谱的形状示意图。图6是利用该方法本文档来自技高网
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一种大视场高分辨三维衍射层析显微成像方法

【技术保护点】
1.一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法,其

【技术特征摘要】
1.一种基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法,其特征在于步骤如下:步骤一,原始强度图像采集,将LED光源作为传统显微镜的照明光源,LED面板上的每颗LED依次被点亮,入射光经过聚光镜后从各个不同的入射角下照射样品,并且在被测的厚样品为聚焦情况下,由相机在同步触发信号下采集一系列不同照明角度下的强度图像其中某一个位置下采集的光强为步骤二,根据LED阵列中每颗LED在空间中的坐标位置计算出在照明系统中每个LED灯对应的入射光的空间频率kin=(kx,ky);步骤三,初始化被测物体的大视场高分辨三维频谱三维频谱矩阵像素个数分别为Nx,Ny,Nz,且该初始化矩阵满足每个方向上的最小采样数与最终的成像分辨率要求;步骤四,三维频谱迭代重构,将每个照明角度下所拍摄的强度图像迭代至初始化的三维频谱中,并进行多轮迭代;步骤五,迭代得出被测物体的三维频谱,并将该三维频谱变换至空域,最终得到被测的三维物体大视场高分辨的折射率信息分布n(r)。2.根据权利要求1所述的基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法,其特征在于在步骤二中:根据LED面板上被点亮的LED空间位置计算出所对应的入射光空间频率kin,当kin小于所用显微物镜可探测空间频率NAobj/λ时,此时所拍摄的图像为明场图像。而当其中kin大于NAobj/λ时,为暗场光线,其中NAobj为显微物镜的数值孔径,λ为不同介质中的归一化波长。3.根据权利要求1所述的基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法,其特征在于在步骤三中:被测物体的初始化三维频谱的像素尺寸必须满足最终的成像分辨率,且三维矩阵像素个数分别Nx,Ny,Nz满足每个方向上的最小采样数,其中k为三维频域变量,当最大照明数值孔径为NAill,且时,该成像方法最终可达的横向分辨率的空间频率为:轴向最高可达空间频率为:故最终初始化的三维频谱的像素分辨率必须大于系统的横向分辨率:代入Δux,y后可得关系式:其中ΔXpixel为初始化之后的三维物函数的像素尺寸。4.根据权利要求1所述的基于LED阵列照明的大视场高分辨三维傅里叶叠层衍射层析显微成像方法,其特征在于在步骤四中:当入射光线的空间频率为kin=(kx,ky)时,利用傅里叶衍射层析定理公式:即可得到在某确定入射光空间频率下,对应的埃瓦尔德球壳上的...

【专利技术属性】
技术研发人员:左超李加基陈钱孙佳嵩冯世杰张玉珍顾国华张佳琳范瑶丁君义
申请(专利权)人:南京理工大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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