用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒、检测方法及应用技术方案

本发明专利技术涉及微生物耐药性技术领域，具体公开一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒、检测方法及应用。本发明专利技术设计了acr耐药通路的4个基因的引物，并且以16S rDNA为内参基因。使用Fast Start Universal SYBR Green Master(Roche Diagnostics GmbH,Germany)抗性基因检测试剂盒检测基因的表达量，使用高通量荧光定量PCR仪进行扩增，两株细菌的氟喹诺酮相关基因的相对表达量和细菌之间的差异表达倍数可以直观地反应出来，更加科学和严谨，填补技术空白。 1

【技术实现步骤摘要】
用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒、检测方法及应用
本专利技术涉及微生物耐药性
，尤其涉及一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒、检测方法及应用。
技术介绍
acr耐药外排系统与大肠杆菌抵抗药物杀伤的主要外排泵，多药耐药外排泵：就是对大肠杆菌体内的药物有外排功能，并且不是针对性的，是大肠杆菌保护自己不被药物杀死的一个外排系统，比如使用抗生素，大肠杆菌会被杀死，而大肠杆菌被杀死的原因是因为抗生素在大肠杆菌体内产生了毒害作用，而大肠杆菌的这个耐药外排泵可以把这些对自己有毒害作用的药物排出去，从而变得耐药，人如果感染了这种细菌，用抗生素的效果就不太好。目前尚无检测大肠杆菌耐药外排系统的方法，在实际用药中，由于该系统活跃程度的不同，治疗效果受到很大影响，不能更好的指导用药。
技术实现思路
针对现有尚无检测大肠杆菌耐药外排系统的方法等问题，本专利技术提供一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒。进一步地，本专利技术还提供一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法。进一步地，本专利技术还提供所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒或所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法在大肠杆菌药物流出系统acr领域中的应用。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于高通量荧光定量PCR检测大肠杆菌药物流出系统acr，所述检测试剂盒包括16SrDNA为内参基因的acrF、acrR、acrE、acrS基因的引物，所述引物的序列如下：16S的上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S的下游引物：GGTTACCTTGTTACGACTT；acrF的上游引物：GCGGCCAGGCACAAAA；acrF的下游引物：TACGCTCTTCCCACGGTTTC；acrR的上游引物：GCGCTGGAGACACGACAAC；acrR的下游引物：GCCTTGCTGCGAGAACAAA；acrE的上游引物：AAATACATCAGCCAGCAGGAG；acrE的下游引物：GTTCAGTCGTTTGCCCATTAG；acrS的上游引物：AAAAGAACCAAAGCCGAAGC；acrS的下游引物：CGAAGTGCCAGTAGATAGCG。进一步地，本专利技术提供一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，所述检测方法为高通量荧光定量PCR方法，所述检测方法至少包括以下步骤：步骤1、从待测样品中提取DNA样品；步骤2、采取上述大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒对步骤1所提取的所述DNA样品使用高通量荧光定量PCR仪进行扩增反应；步骤3、对所得结果进行数据分析。本专利技术设计了acr耐药通路的4个基因的引物，并且以16SrDNA为内参基因。使用FastStartUniversalSYBRGreenMaster(RocheDiagnosticsGmbH,Germany)抗性基因检测试剂盒检测基因的表达量，使用高通量荧光定量PCR仪进行扩增，两株细菌的氟喹诺酮相关基因的相对表达量和细菌之间的差异表达倍数可以直观地反应出来，更加科学和严谨，填补技术空白。相应地，本专利技术提供了所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒或所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法在大肠杆菌药物流出系统acr领域中的应用。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于高通量荧光定量PCR检测大肠杆菌药物流出系统acr，所述检测试剂盒包括16SrDNA为内参基因的acrF、acrR、acrE、acrS基因的引物，所述引物的序列如下：16S的上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S的下游引物：GGTTACCTTGTTACGACTT；acrF的上游引物：GCGGCCAGGCACAAAA；acrF的下游引物：TACGCTCTTCCCACGGTTTC；acrR的上游引物：GCGCTGGAGACACGACAAC；acrR的下游引物：GCCTTGCTGCGAGAACAAA；acrE的上游引物：AAATACATCAGCCAGCAGGAG；acrE的下游引物：GTTCAGTCGTTTGCCCATTAG；acrS的上游引物：AAAAGAACCAAAGCCGAAGC；acrS的下游引物：CGAAGTGCCAGTAGATAGCG。进一步地，本专利技术提供一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，所述检测方法为高通量荧光定量PCR方法，所述检测方法至少包括以下步骤：步骤1、从待测样品中提取DNA样品；步骤2、采取上述大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒对步骤1所提取的所述DNA样品使用高通量荧光定量PCR仪进行扩增反应；步骤3、对所得结果进行数据分析。本专利技术设计了acr耐药通路的4个基因的引物，并且以16SrDNA为内参基因。使用FastStartUniversalSYBRGreenMaster(RocheDiagnosticsGmbH,Germany)抗性基因检测试剂盒检测基因的表达量，使用VIIA@7(ABI,USA)高通量荧光定量PCR仪进行扩增，两株细菌的氟喹诺酮相关基因的相对表达量和细菌之间的差异表达倍数可以直观地反应出来，更加科学和严谨，填补技术空白。优选地，所述高通量荧光定量PCR反应体系组成如下：RocheFastStartUniversalSYBRGreenMaster：5μL，ddH2O：3μL，上游引物：0.75μL，下游引物：0.75μL，DNA样品：0.5μL。优选地，所述DNA样品的浓度为5ng/uL，所述上游引物和下游引物的浓度均为0.1μM。优选地，所述步骤2中扩增反应的条件为：首先在95℃条件下反应10min，进行1次循环；其次在95℃条件下反应30s，进行40次循环，最后在60℃条件下反应30s，进行40次循环。优选地，所述步骤3中采取数据的平均值、标准偏差、倍数变化值、热图进行分析。相应地，本专利技术提供了所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒或所述的用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法在大肠杆菌药物流出系统acr领域中的应用。为了更好的说明本专利技术实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。实施例1本专利技术提供一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，所述检测方法为高通量荧光定量PCR方法，所述检测方法包括以下步骤：步骤1、从待测样品中提取DNA样品；、临床上对于大肠杆菌病病例分离出大肠杆菌后，首先我们提取分离到的致病性大肠杆菌DNA，以便进行下一步测定。DNA提取使用SoilPuregeneDNAIsolationKit(货号：DN2701，公司：Aidlab，国家：中国)。步骤如下：取0.5mL菌液离心后倒去上清，加入0.5mL溶液SUS，用枪头搅拌后短暂涡旋帮助重悬。加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，短暂涡旋帮助混匀。加入120μL溶液LYS，短暂涡旋混匀，65℃温育30分钟，期间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用

【技术特征摘要】
1.一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于高通量荧光定量PCR检测大肠杆菌药物流出系统acr，所述检测试剂盒包括16SrDNA为内参基因的acrF、acrR、acrE、acrS基因的引物，所述引物的序列如下：16S的上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S的下游引物：GGTTACCTTGTTACGACTT；acrF的上游引物：GCGGCCAGGCACAAAA；acrF的下游引物：TACGCTCTTCCCACGGTTTC；acrR的上游引物：GCGCTGGAGACACGACAAC；acrR的下游引物：GCCTTGCTGCGAGAACAAA；acrE的上游引物：AAATACATCAGCCAGCAGGAG；acrE的下游引物：GTTCAGTCGTTTGCCCATTAG；acrS的上游引物：AAAAGAACCAAAGCCGAAGC；acrS的下游引物：CGAAGTGCCAGTAGATAGCG。2.一种用于大肠杆菌药物流出系统acr的检测方法，其特征在于：所述检测方法为高通量荧光定量PCR方法，所述检测方法至少包括以下步骤：步骤1、从待测样品中提取DNA样品；步骤2、采取权利要求1所述大肠杆菌药物流出系统acr的检测试剂盒对步骤1所提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：张石磊，王春光，张铁，吕建存，贾泽，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北,13