一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法技术

本发明专利技术提供了一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，包括以下步骤：根据芥蓝基因家族各成员的CDS全长，分析其各成员的靶位点，筛选共同靶序列；根据选定的靶序列，构建CRISPR/Cas9表达载体，然后转化农杆菌感受态，浸染外植体，再对外植体进行组织培养，获得突变植株。本发明专利技术通过一次转化同时敲除芥蓝植物体内同一基因家族的多个基因，可得到大量的不同成员突变的突变体材料，提高了突变的效率，节省了工作量，节约了工作时间，解决了以往基因家族突变为获得不同的单突和多突材料，需分别设计多个载体，各载体需进行单独转化，同时诱导时间长和难度大等问题，进而体现了本发明专利技术同时、高效的优势。 1

【技术实现步骤摘要】
一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法
本专利技术属于植物分子生物学
，具体涉及一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法。
技术介绍
分子生物学研究发现很多基因是以基因家族的形式存在。基因家族是指由一个共同的祖先基因经过重复(duplication)和突变(mutation)产生的、外显子中具有相似的序列的一组相关基因。同一家族中的成员有时紧密的排列在一起，成为一个基因簇；更多的时候，它们却分散在同一染色体的不同部位，甚至位于不同染色体上，具有各自不同的表达调控模式。随着研究的深入，科研人员发现作物中很多与产量、品质、抗性等重要性状相关的基因是以基因家族的形式存在，在作物体内存在多个成员且可能各自负责不同的功能。因此，明确同一家族不同成员的功能也是分子生物学研究中一直以来的热点。获得突变体材料进行研究则是基因家族各成员功能研究的一种重要途径。突变体(mutant)是指发生基因突变或发生染色体变异的个体，是遗传学研究所必需的基础材料，突变体还在作物的遗传育种和品质改良上有重要作用。后基因组时代是功能基因组学的时代。功能基因组学是在研究生物有机体内各种基因生物学功能的基础上，进一步解析所有基因协调发挥作用的机制，以及完成一系列生长发育的过程。要准确揭示每个基因的功能及它们之间的相互联系，就要进行单个基因和多个基因的突变表型及其时空表达特征的分析。传统的诱导突变体的方法有自发突变、体细胞无性系变异突变以及理化诱导突变体，都只能得到单基因突变的个体，且工作量大，耗费人力材力，突变效率低，时间久长。现在流行的生物技术诱导突变体，尤其是CRISPR/Cas9系统的出现，提高了突变体诱导的效率。但目前利用CRISPR/Cas9系统敲除多基因的方式大都是选择几个不同的靶位点逐一进行敲除。芥蓝是一种原产于中国的十字花科的蔬菜，广泛分布于我国的南部和东南亚。它属于CC型染色体组，二倍体，有18条染色体，以其花薹和嫩叶为主要实用部分。因其富含维生素C、类胡萝卜素、芥子油苷和总酚等成分，有很高的营养价值和保健功效，备受人们的喜欢。在芥蓝上，诱导单基因突变体时，为保证转基因植株的获得，至少要做3000-4000个外植体，大约需4个月左右的时间方能获得抗性芽，且转化频率通常仅在0.5-1％甚至更低。而当遇到基因家族时，成员有2个及2个以上，为获得各种类型的单突和多突突变体材料，这时至少要增加2倍(依基因家族的成员不同而不同)以上的工作量和工作时间以及多基因突变体诱导的周期。因此研究一种同时针对基因家族多个成员的芥蓝突变体的高效创制方法对于基因功能的研究以及芥蓝蔬菜的遗传育种和品质的提高是非常必要的。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，可有效解决以往基因家族突变为获得不同的单突和多突材料，需分别设计多个载体，各载体需进行单独转化，其诱导时间长和难度大等问题。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，包括以下步骤：(1)基因靶序列的选择根据芥蓝基因家族各成员的CDS全长，分析各成员的靶位点，筛选共同靶序列；其中，筛选标准为：选择高度保守、一致的序列作为同一基因家族多个成员的共同靶序列，共同靶序列不超过5个碱基的错配，GC含量在50％-70％，同时共同靶序列内不存在连续的4个T且能够响应U6启动子；(2)CRISPR/Cas9表达载体的构建根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo序列，与pSG载体连接，转化，得重组质粒，然后分别对重组质粒和pCC质粒进行双酶切，回收目的条带，然后进行连接，构建CRISPR/Cas9表达载体，最后转化农杆菌感受态用于浸染；(3)农杆菌介导的遗传转化制备农杆菌浸染液，浸染外植体，然后对外植体进行组织培养，获得转基因突变植株。进一步地，步骤(1)中选择没有碱基错配的序列作为共同靶序列。进一步地，步骤(2)中所用农杆菌为GV3101农杆菌或EHA105农杆菌。进一步地，步骤(3)中具体过程为：将芥蓝种子接种于M1培养基上，制备无菌苗；切取无菌苗的带柄子叶，接种于M2培养基上预培养4-5天；将转化农杆菌感受态的CRISPR/Cas9表达载体制备成浸染液，然后浸染预培养后的带柄子叶，最后在M3培养基上进行共培养；共培养结束后转入M4培养基培养6-7天，再转入M5培养基进行抗性筛选并继代，最后转入M6培养基中进行生根培养，最终获得转基因突变植株。进一步地，M1培养基包括1/2MS培养基、蔗糖20g/L和琼脂粉7.5g/L，且pH值为5.8；M2培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L和2,4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，且pH值为5.8；M3培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L和萘乙酸0.03mg/L，且pH值为5.8；M4培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L、羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L，且pH值为5.8；M5培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及的潮霉素B10-15mg/L，且pH值为5.8；M6培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及潮霉素B10-15mg/L，且pH值为5.8。本专利技术提供的同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，具有以下有益效果：(1)有关芥蓝植物体内的基因敲除，现有技术中是选择几个不同的靶位点对其进行逐一敲除，其费时费力，效率低，成本较高，而本专利技术则是通过筛选芥蓝植物体内同一基因家族中多个成员高度保守的共同靶序列，然后根据筛选出的共同靶序列构建CRISPR/Cas9表达载体，最后采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因突变植株。本方法通过一次转化便可同时敲除芥蓝植物体内多个基因，不必筛选几个不同的靶位点进行逐一敲除，其从原理上体现了本专利技术同时、高效的优势，从而提高了其突变效率，节省了成本，降低了实验难度和强度，同时还可以得到大量的突变体材料。(2)在本专利技术方法中重点在于对同时、高效的体现，具体为：在传统操作中，基于芥蓝植物构建一个CRISPR/Cas9表达载体需花费大约1500-2000元；在芥蓝植物上利用CRISPR/Cas9表达载体创制一个单基因突变体大约需要7-8个月至一年的时间，若基因家族存在2个及2个以上的成员，就需要构建3个及3个以上的载体，然后逐一进行敲除，需要至少2倍以上的周期；在制备多突突变体时会在一个单突突变体的基础上再通过杂交或进一步敲除创制多突突变体，或构建多个载体分别进行突变，需要很大的工作量，不便于管理。而采用本专利技术方法，只需通过筛选同一基因家族中不同成员的共同靶序列，然后通过该共同靶序列构建一个载体，便可对多个基因进行同时敲除，当应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，其特征在于，包

【技术特征摘要】
1.一种同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)基因靶序列的选择根据芥蓝基因家族各成员的CDS全长，分析各成员的靶位点，筛选共同靶序列；其中，筛选标准为：选择高度保守、一致的序列作为同一基因家族多个成员的共同靶序列，共同靶序列不超过5个碱基的错配，GC含量在50％-70％，同时共同靶序列内不存在连续的4个T且能够响应U6启动子；(2)CRISPR/Cas9表达载体的构建根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo序列，然后构建CRISPR/Cas9表达载体，最后转化农杆菌感受态；(3)农杆菌介导的遗传转化制备农杆菌浸染液，浸染外植体，然后对外植体进行组织培养，获得转基因突变植株。2.根据权利要求1所述的同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中选择没有碱基错配的序列作为共同靶序列。3.根据权利要求1所述的同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，其特征在于，步骤(2)中所用农杆菌为GV3101农杆菌或EHA105农杆菌。4.根据权利要求1所述的同时针对芥蓝同一基因家族多个成员突变体的高效制备方法，其特征在于，步骤(3)中具体过程为：将芥蓝种子接种于M1培养基上，制备无菌苗；切取无菌苗的带柄子叶，接种于M2培养基上预培养4-5天；将转化农杆菌感受态的CRISPR/Cas9表达载体制备成浸染液，然后浸染预培养后的带柄...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙勃，张芬，郑爱红，汤浩茹，薛生玲，江雷雨，袁巧，江敏，陈清，张勇，罗娅，王小蓉，王燕，刘泽静，李梦瑶，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51