木犀草苷的偶联物及其制备方法与应用技术

木犀草苷的偶联物及其制备方法与应用。本发明专利技术公开了一种通式(I)的木犀草苷的偶联物，由木犀草苷与产生免疫原性的载体物质钥匙孔蓝蛋白(KLH)偶联构成，其中n为与一个钥匙孔蓝蛋白分子结合的木犀草苷的分子数，KLH为钥匙孔蓝蛋白，分子量范围是450KDa～13000KDa。本发明专利技术还公开了所述的偶联物的制备方法，即将木犀草苷与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明专利技术的木犀草苷的偶联物通过免疫新西兰大白兔，制备了效价达到1∶64000的抗血清，其最低检测限为29.27ng/ml。本发明专利技术具有简便，快捷，特异，准确的特点，为制备木犀草苷的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。

Conjugates of luteolin and their preparation and Application

Conjugates of luteolin and their preparation methods and applications. The present invention discloses a coupling of the common formula (I) of luteolin glycoside, which is composed of luteolin glycoside and the carrier substance key orifice cyanin (KLH) producing immunogenicity, in which n is the molecular number of the luteolin glycoside combined with a keyhole cyanin molecule, and KLH is a keyhole cyanin, and the molecular weight range is 450KDa to 13000KDa. The invention also discloses the preparation method of the coupling, which is connected with the carrier substance producing immunogenicity, and is combined with a coupling that produces antibodies in the animal immune system. The conjugate of luteolin is prepared by immunizing New Zealand white rabbits, and the antiserum with a titer of 1 to 64000 is prepared, with a minimum detection limit of 29.27ng/ml. The invention has the advantages of simplicity, shortcut, specificity and accuracy, and provides the basis for preparing the ELISA kit for the preparation of luteolin.

【技术实现步骤摘要】
木犀草苷的偶联物及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种小分子半抗原的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及木犀草苷的偶联物及其制备方法与应用。
技术介绍
本专利技术涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书：木犀草苷：中国标准品质检所产品KLH：钥匙孔蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin)，Sigma公司产品DMF：二甲基甲酰胺，北京百灵威(J&K)公司产品高碘酸钠：北京百灵威(J&K)公司产品透析袋：北京索莱宝(Solarbio)公司产品PBS：磷酸缓冲液(PhosphateBufferSaline)(0.01M，pH＝7.40)CBS：碳酸盐缓冲溶液(CarbonateBufferSaline)(0.05M，pH＝9.6)。金银花药用历史悠久，是我国常用的传统珍贵药材，广泛应用于医药、食品和日用品工业中。目前，金银花和山银花药材混用严重，质量差别巨大。市场上山银花价格约为金银花的1/3，许多不良厂商采用山银花冒充金银花入药以获得高额利润。金银花与山银花外观性状接近，不易鉴别，真假难辨，亟待建立快速灵敏的检测方法。2010版《中国药典》确定了以木犀草苷作为金银花的标志性成分来控制其质量，同时，将是否含有木犀草苷作为区别正品金银花和山银花等同科植物的主要化学指标。木犀草苷(Luteoloside)又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-glucoside)，青兰苷(Cynaroside)，为黄酮苷类化合物，分子式为C21H20O11，分子量：448.41。现代药理学证明木犀草苷具有较强的呼吸道杀菌作用，可增强毛细血管的舒张，降低胆固醇，对缺血缺氧培养的心肌细胞具有保护作用。随着对金银花有效成分的分析与研究，木犀草苷的抗病毒活性也逐渐明晰，在抗肿瘤方面表现出较好的作用。目前，测定金银花中木犀草苷含量主要采高效液相色谱法(HPLC法)和紫外光谱法(UV)两种常用的检测方法。然而，目前运用的这些检测方法均存在不同程度的不足，UV法方法简单，操作简便，费用少，但是测定的结果准确度相对不高。HPLC法检测敏感度高，操作自动化，分离效率高，选择性好，应用范围广，具有检测准确的优势，但是一般需要进行比较复杂的样品前处理，对仪器操作人员要求较高、高效液相色谱仪的价格及日常维护费用较贵，分析成本较高，不能体现出“快速”检测，在实际工作中较难推广。因此，亟需一种简便、快速的质量分析方法，能够准确、快速地检测金银花的真伪优劣。酶联免疫检测法(ELISA)提供了一种极好的检测手段。该方法具有快速，准确，简易，不需要专人操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的检测手段。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。木犀草苷是一种小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之半抗原。所以，必须把木犀草苷转化为能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。经检索，世界上尚未有关于木犀草苷的免疫原合成及抗体制备过程的报道，不能满足检测需要，因此研究木犀草苷的免疫原的合成显得格外重要。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是：提供一种能引发动物免疫系统产生针对木犀草苷有特异反应的抗体的免疫原，即木犀草苷的偶联物及其制备方法。同时，本专利技术还提供了所述的木犀草苷的偶联物作为免疫原在制备木犀草苷特异反应抗体中的应用。本专利技术的木犀草苷的偶联物，由木犀草苷半抗原与产生免疫原性的载体物质偶联而成，所述载体物质为优选蛋白质，蛋白片段，合成多肽或半合成多肽。上述的木犀草苷的偶联物，其中所述产生免疫原性的载体物质是钥匙孔蓝蛋白。本专利技术所述的木犀草苷的偶联物，其结构通式如(I)其中，n为与一个钥匙孔蓝蛋白结合的木犀草苷的分子个数，KLH为钥匙孔蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin)，分子量范围是450KDa～13000KDa；上述偶联物显示出如下物化特征：(1)外观：棕色粉末状固体；(2)紫外吸收光谱：337nm。上述的木犀草苷的偶联物的制备方法是：将木犀草苷与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。上述的木犀草苷的偶联物的制备方法具体步骤如下：(1)溶液A的制备：将10.0mg小分子化合物木犀草苷溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入含有4.8mg高碘酸钠溶液0.5ml，室温下避光搅拌反应1h；(2)溶液B的制备：将30mgKLH溶于10ml0.05M碳酸盐缓冲溶液(CBS)中，备用；(3)将溶液A逐滴加入溶液B中，在室温下避光搅拌反应6h，得溶液C；(4)溶液C转移到透析袋中，用浓度为0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)搅拌透析72h，之后更换用蒸馏水透析20～30h，每6h更换一次透析液，透析过程在4℃下进行；(5)冻干透析液，得到棕色木犀草苷的偶联物。在上述制备中，木犀草苷与高碘酸钠摩尔比为1∶1。在上述制备中，木犀草苷与钥匙孔蓝蛋白的质量数比为1∶3。本专利技术所述的木犀草苷的偶联物作为免疫原在制备木犀草苷特异反应抗体中的应用。利用本专利技术的技术方案可以成功地把半抗原木犀草苷与载体蛋白特别是钥匙孔蓝蛋白KLH偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原——木犀草苷的偶联物。利用本专利技术所述的木犀草苷的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔，成功地获得了对半抗原木犀草苷有特异反应的抗体。经ELISA实验鉴定，利用本专利技术所述的木犀草苷的偶联物作为免疫原制备的木犀草苷特异反应抗体，其抗血清效价达到1∶64000，其最低检测限为29.27ng/ml。上述的木犀草苷的偶联物以及高效价的木犀草苷特异反应抗体的制备成功，为制备木犀草苷的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。由于本专利技术所述方法具有简易，快速，特异，准确的特点，可用于金银花中木犀草苷的含量测定，可现场操作，节省大量的检测时间，弥补了仪器法费时较长，需要大型仪器设备支持的不足。具体实施方式：实施例1(1)溶液A的制备：将10.0mg小分子化合物木犀草苷溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，加入含有4.8mg高碘酸钠溶液0.5ml，室温下避光搅拌反应1h；(2)溶液B的制备：将30mgKLH溶于10ml0.05M碳酸盐缓冲溶液(CBS)中，备用；(3)将溶液A逐滴加入溶液B中，在室温下避光搅拌反应6h，得溶液C；(4)溶液C转移到透析袋中，用浓度为0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)搅拌透析72h，之后更换用蒸馏水透析20～30h，每6h更换一次透析液，透析过程在4℃下进行；(5)冻干透析液，得到棕色木犀草苷的偶联物。通过紫外吸收光谱(吸收值)确定产物的偶联情况，本专利技术的木犀草苷的偶联物在337nm处有特征紫外吸收峰。实施例2抗体的制备及酶联免疫检测1.抗体的制备选择上述实施例1所制备的木犀草苷的偶联物作为免疫原进行动物免疫实验以制备抗体。取1mg/ml的木犀草苷的偶联物的溶液1ml，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化后，经皮下多点注射给6只体重2kg的雄性健康新西兰大白兔，1ml/只，21天以后，以0.5mg/ml的木犀草苷的偶联物溶液1ml与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行二免，二免以后，每隔15天加强免疫一次，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心脏取血，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木犀草苷的偶联物，由木犀草苷半抗原与产生免疫原性的载体物质偶联而成，

【技术特征摘要】
1.一种木犀草苷的偶联物，由木犀草苷半抗原与产生免疫原性的载体物质偶联而成，所述载体物质为优选蛋白质，蛋白片段，合成多肽或半合成多肽。2.如权利要求1所述的木犀草苷的偶联物，其中所述产生免疫原性的载体物质是钥匙孔蓝蛋白。3.如权利要求2所述的木犀草苷的偶联物，其结构通式如(I)其中，n为与一个钥匙孔蓝蛋白结合的木犀草苷的分子个数，KLH为钥匙孔蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin)，分子量范围是450KDa～13000KDa；上述偶联物显示出如下物化特征：(1)外观：棕色粉末状固体；(2)紫外吸收光谱：337nm。4.如权利要求1～3中任一项所述的木犀草苷的偶联物的制备方法，其特征是：将木犀草苷与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。5.如权利要求4所述的木犀草苷的偶联物的制备方法，由如下步骤完成：(1)溶液A的制备：将...

【专利技术属性】
技术研发人员：郗日沫，邓川，尹永梅，孟萌，李小刚，龙浩，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12