一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用，拮抗细菌枯草芽孢杆菌菌株DYr3.3，CCTCC M 2018024，步骤是：（1）采集紫枝玫瑰根，将根切成大小的组织，经过70%酒精消毒，经无菌水冲洗后，放置于PDA培养基上暗培养，培养后，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落；（2）分离纯化后，获得一种拮抗细菌枯草芽孢杆菌菌株DYr3.3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该菌株DYr3.3在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用。菌株DYr3.3经过液体发酵获得的DYr3.3菌液可以阻止因梨轮纹病和炭疽病危害造成的梨果实腐烂，对梨果实的腐烂具有良好的防病效果，显著抑制梨果实腐烂，防效率可达100％，广泛应用于梨果实腐烂病的防治。

A broad spectrum bacteriostatic activity Bacillus subtilis DYr3.3 and its preparation method and Application

The invention discloses a broad-spectrum bacteriostasis Bacillus subtilis DYr3.3 and its preparation method and application, Antagonistic Bacterial Bacillus subtilis strain DYr3.3 and CCTCC M M 2018024. The steps are: (1) collecting Purple Branch rose root, cutting root into size tissue, sterilizing by 70% alcohol and placing it in PDA culture after being washed by sterile water. After culture, the bacterial colonies were transferred to the new PDA medium to separate and purify a single colony on the new PDA medium. (2) after separation and purification, a bacterial Bacillus subtilis strain DYr3.3 was obtained. The nucleotide sequence, such as SEQ ID NO:1, showed that the strain DYr3.3 was prepared for the treatment or prevention of pear fruit rot. The application of the medications of rotten disease. The DYr3.3 bacteria solution obtained by the strain DYr3.3 can prevent the rot of pear fruit caused by pear rotation disease and anthrax disease. It has a good effect on the rot of pear fruit, and significantly inhibits the rot of pear fruit, and the efficiency can reach 100%. It is widely used in the prevention and control of pear fruit rot and rot disease.

【技术实现步骤摘要】
一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用
本专利技术属于植物病害生物防治
，更具体涉及一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3，同时还涉及一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3的制备方法，再涉及一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3的用途。
技术介绍
由于果蔬产品的生产地都远离城市，而且成熟期也相对集中，需要有一定的贮藏和运输周期，在此期间大量的采后损失，特别是果蔬的腐烂。据报导，发达国家有10％-30％的新鲜果品损失于采后的腐烂，在缺乏贮运冷藏设备的发展中国家，其腐损率高达40％-50％。目前对这类病害的防治仍然以化学药剂防治为主，这不仅对人、畜以及生态环境产生严重危害，还会增加农产品中有毒化学物质的残留量，同时也容易诱致植物对病原菌抗药性的产生。近年来，已经有研究者采用芽孢杆菌代替部分传统的化学农药，为果蔬采后病害防治提供新的研究思路和方法【田世平和范青，控制果蔬采后病害的生物学技术，植物学通报，2000，17(3)：211-217】。梨果实采收后在储藏期间经常会发生腐烂，采后储藏期的腐烂常由轮纹病菌和炭疽病菌侵染所致。目前，已有研究采用芽孢杆菌来控制储藏期的苹果腐烂，包括采用地衣芽孢杆菌防治由苹果轮纹病菌和炭疽病菌引起的苹果腐烂病【纪兆林等，地衣芽孢杆菌对苹果轮纹病菌和炭疽病菌的抑制及其对贮藏期苹果轮纹病的防治作用，果树学报，2008，25(2)：209～214】，处理苹果果实防病率达到33.0%；采用解淀粉芽胞杆菌NCPSJ7对采后苹果轮纹病进行防治【黄玲玲等，采用解淀粉芽胞杆菌NCPSJ7对采后苹果轮纹病的生物防治作用，中国食物与营养2015，21(2)：20-24】；采用枯草芽孢杆菌B-903控制采后苹果轮纹病，病菌侵入前接种B-903菌液10倍液、20倍液处理效果较好，第7d的抑制效果达64.4-68.2%；病菌侵入发病后用B-903处理的抑制效果为13.5-25.8%【赵白鸽等，枯草芽孢杆菌B-903对苹果轮纹菌的抑菌作用及其对病害的控制效果，植物病理学报，1996，27（3）213-214】。以上研究主要采用各种芽孢杆菌控制采后苹果轮纹病和炭疽病，但各个菌株效果都不够理想，且工作浓度都偏低（原液或20倍稍加稀释），不能满足生产上实际应用需要。也有人筛选和利用枯草芽孢杆菌防治采后梨轮纹病，从梨样品中分离到了21株枯草芽孢杆菌，可以抑制接种梨轮纹菌后梨果实的腐烂，抑制病斑扩展效率为40％以上【丁芳兵，筛选和利用枯草芽孢杆菌防治梨轮纹病，江苏农业学报，2009，25(5)：1002-1006】，还远不能满足生产上实际应用需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DYr3.3，该菌株具有广谱抗真菌活性，对梨树的主要病原真菌，包括梨轮纹病菌（Botryosphaeriaberengeriana）、梨炭疽菌（包括Colletotrichumfructicola、Colletotrichumgloeosporioides）、梨腐烂病菌（Valsamalivar.pyri）、梨胴枯病菌（Phomopsisfukushii）等）均有显著的抑菌活性。此外，还对其它常见园艺作物病原真菌，如山茶刺盘孢菌（Colletotrichumcamelliae）、拟茎点霉菌（Phomopsissp.）、茶拟盘多毛孢（Pestalotiopsis_theae）、柑橘青霉菌（Penicilliumitalicum）均具有良好的拮抗活性。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌的制备方法，方法易行，操作简便，经过液体发酵后，获得了便于溶于水中使用和耐储藏的液体制剂，测定孢子浓度为4.41×107cfu/mL本专利技术还有一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DYr3.3在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用，该菌株的发酵产品对梨果实的腐烂具有良好的防病效果，显著抑制梨果实腐烂，防效可以达到100％。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施：本研究发现了一株枯草芽孢杆菌菌株DYr3.3，该菌株可以强烈抑制梨果实因轮纹菌和炭疽菌引起的腐烂，效果可以达到100%，具有显著的实际应用潜力。一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌的制备方法，其步骤是：（1）在湖北省黄石市大冶玫瑰地采集紫枝玫瑰根，将根切成长约0.5cm大小的组织，经过70%（体积比）酒精消毒1min，经无菌水冲洗2-3次后，放置于PDA培养基上24－26℃暗培养，培养34－38h后，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落；所述的PDA培养基的制备方法为：将200g马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂粉溶于1000mL蒸馏水，调pH值至6.8－7.2左右；（2）分离纯化后，获得一种来源于紫枝玫瑰根部的拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株DYr3.3，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，菌株DYr3.3于2018年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM2018024，DYr3.3在平板对峙实验中对梨轮纹菌（见图1）和多种致病菌（见图3）具有很强的拮抗能力，对梨果实腐烂具有良好防效；一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用，其步骤是：A、无菌环境下挑取DYr3.3菌株单菌落，接种于装有装有90mL最适培养液A（3.0％（质量体积比）葡萄糖，0.5％（质量体积比）酵母提取粉，0.3％（质量体积比）氯化钠，0.1％（质量体积比）硫酸镁，调节pH值6.0～6.5）的250mL三角瓶中，28°C、150r/min振荡培养24h，获得种子培养菌液。B、准备500ml三角瓶10个，每瓶装200mL培养液A，每瓶按照1:100的比例加入步骤A得到的种子培养菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，28°C下150r/min振荡培养48h，获得DYr3.3发酵液，浓度为4.89×106cfu/mL。C、取步骤B得到的DYr3.3菌株发酵液，用清水稀释100倍，将梨果实浸泡30s后捞出，晾干，低温（4°C）或室温（20－25°C，以下相同）储藏即可。菌株DYr3.3经过液体发酵获得的DYr3.3菌液可以阻止因梨轮纹病和炭疽病危害造成的梨果实腐烂，可以应用于梨果实腐烂病的防治。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：（1）梨果实采收后在储藏期间经常会发生腐烂，采后储藏期的腐烂常由轮纹病菌和炭疽病菌侵染所致。目前尚无有效预防梨果实腐烂的芽孢杆菌类生防制剂，枯草芽孢杆菌DYr3.3具有应用于防治梨果实腐烂的显著效果，具有应用于果蔬保鲜的优点和效果。（2）商品化开发的枯草芽孢杆菌菌株主要用于大田作物田间病害防治，而非果实产后病害防治，如江苏农业科学院植物保护研究所发现的枯草芽孢杆菌B-916菌株已进行农药登记，应用于水稻纹枯病田间防治；南京农业大学生防菌B3(商品名麦丰宁)应用于小麦纹枯病田间防治。因此，菌株DYr3.3具有不同于其它已经商品化枯草芽孢杆菌菌株的应用方向。（3）前期已经有人筛选了应用于防治轮纹病菌的枯草本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3，其特征在于：拮抗细菌枯草芽孢杆菌(

【技术特征摘要】
1.一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3，其特征在于：拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株DYr3.3，保藏编号为CCTCCM2018024。2.根据权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3，其特征在于：所述的拮抗细菌枯草芽孢杆菌DYr3.3菌株中含有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。3.权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用，其步骤是：A、无菌环境下挑取DYr3.3菌株单菌落，接种于装有90mL最适培养液A的250mL三角瓶中，28°C、150r/min...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文兴，荚恒霞，蔡丽，王利平，洪霓，王国平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42