O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体以及使用其产生L-甲硫氨酸的方法技术

本申请涉及新型O‑乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体、编码其的多核苷酸、包括该多核苷酸的载体、能够表达该变体的菌株和使用该变体产生L‑甲硫氨酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体以及使用其产生L-甲硫氨酸的方法
本公开内容涉及新型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体、编码其的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、能够表达该变体的菌株、和使用该变体产生L-甲硫氨酸的方法。
技术介绍
L-甲硫氨酸，一种生物体内的必需氨基酸，已被用作饲料、浸剂、药用原料诸如药物的合成原料、和食品添加剂。甲硫氨酸是参与体内转甲基作用的重要氨基酸并且具有提供硫的作用。对于甲硫氨酸的化学合成，主要使用水解5-(β-甲硫基乙基)-乙内酰脲产生L-型和D-型的混合物形式的甲硫氨酸的方法。然而，化学合成导致产生L-型和D-型的混合物形式的甲硫氨酸。同时，使用生物方法可以选择性地产生L-甲硫氨酸，其中通过使用微生物直接发酵或者通过两步法(国际专利公开号WO2008/013432)产生L-甲硫氨酸。具体地，两步法由通过发酵产生L-甲硫氨酸前体的过程和通过酶将L-甲硫氨酸前体转变为L-甲硫氨酸的过程构成。两步法可以选择性地仅产生L-甲硫氨酸并且进一步地通过同一反应同时产生作为副产物的有机酸，更具体地琥珀酸或醋酸。L-甲硫氨酸前体可以包括O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸，并且在转变过程中使用的酶可以包括O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶。为了通过两步法最大化L-甲硫氨酸产生，必要的是确保最大量的发酵的O-酰基高丝氨酸，其是L-甲硫氨酸的前体。同时，用于酶转变以产生L-甲硫氨酸的酶必须具有高转变活性，在微生物中表现出过表达，并且在高浓度的O-酰基高丝氨酸下保持高反应速率。另外地，在当最终产物(即，L-甲硫氨酸和有机酸)以高浓度聚集的时间点酶必须具有低活性抑制并且酶具有热稳定性而不会在反应期间失去它们的活性。在这方面，韩国专利号10-1250651公开了衍生自类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶，其具有比衍生自非类球红细菌的微生物的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶更高的热稳定性，并且因而新近可供在两步法中使用。然而，仍然需要开发酶，其用于两步法等中具有高转变活性和在当最终产物聚集的时间点具有低活性抑制。
技术实现思路
技术问题本公开内容的专利技术人已经努力开发了O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶作为具有改进转变的酶。结果，他们已经证实，与野生型O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶相比，修饰的多肽，其中类球红细菌衍生的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的第196位氨基酸被用除了缬氨酸之外的氨基酸修饰，具有更高的转变和稳定性，从而完成本公开内容。技术方案本公开内容的一个目的是提供O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体。本公开内容的另一目的是提供编码该变体的多核苷酸。本公开内容的仍另一目的是提供包括该多核苷酸的载体。本公开内容的仍另一目的是提供产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体的微生物。本公开内容的仍另一目的是提供使用O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶变体产生甲硫氨酸的方法。本专利技术的有益效果具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的本公开内容的修饰的多肽是满足所有要求的修饰的多肽，诸如用作工业转变酶的高活性、高转变率、在大肠杆菌中过表达的可能性，在当最终产物聚集的时间点的低活性抑制、热稳定性的维持等。因此，本公开内容的修饰的多肽的优势在于它们可以用于L-甲硫氨酸连同作为副产物的醋酸的快速且高效的生产。附图说明图1显示了图解关于如此样品的SDS-PAGE凝胶电泳结果的图像，所述样品在纯化衍生自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶之后的每个步骤中获得最佳方式为了实现以上目的，本公开内容的方面可以提供具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的新型修饰的多肽。该修饰的多肽可以是具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽，其中从衍生自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的氨基酸序列的N-末端的第196位氨基酸，并且具体地从由SEQIDNO:1的氨基酸序列描述的多肽的N-末端的第196位氨基酸，被除了缬氨酸之外的氨基酸取代。更具体地，该修饰的多肽可以是其中从N-末端的第196位氨基酸(即，缬氨酸)被苏氨酸取代的变体。具体地，具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽可以是具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的修饰的多肽，但是修饰的多肽不限于此。与具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的SEQIDNO:1的多肽相比，如此修饰的多肽具有增强的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性。如本文所使用的，术语“修饰”或“变体”是指基因上或非基因上表现出稳定的表型改变的培养产物或个体对象，并且具体地，是指其中衍生自类球红细菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的氨基酸被修饰并因而与其野生型相比能够有效地增大其活性的变体。这种变体的序列可以包括具有与以上修饰的多肽至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性的多肽。具体地，具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的本公开内容的修饰的多肽可以包括SEQIDNO:3的多肽和具有与SEQIDNO:3的序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽。另外地，显而易见的是，具有在部分序列中带有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列同时保留将第196位氨基酸(即，特定位置)修饰为除了缬氨酸之外的氨基酸的任何酶变体，也可以包括在本公开内容的范围内，只要该氨基酸序列具有以上所述的同源性并且具有与该酶的效果对应的效果。另外地，任何多肽，其由可以从已知的基因序列制备的探针(例如，在严格条件下可以与编码该多肽的核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交的多核苷酸)编码并且具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性，也可以非限制性地包括在本公开内容的范围内。如本文所使用的，术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这种条件依赖于多核苷酸的长度和互补程度，并且相关参数在本领域中是公知的，并且在参考文献(例如，J.Sambrook等，同上)中具体描述。例如，该条件可以包括在具有高同源性——80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地97％或更高，并且最具体地99％或更高——的同源性的基因之间进行杂交，而不在同源性低于以上同源性的基因之间进行杂交；或者在60℃、1×SSC和0.1％SDS的用于DNA杂交的常规洗涤条件下，具体地对应于60℃、0.1×SSC和0.1％SDS，并且更具体地对应于68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下，进行一次杂交，具体地两次或三次。在杂交中使用的探针可以是核苷酸序列的互补序列的部分。这些探针可以使用基于已知序列制备的寡核苷酸作为引物和含有该核苷酸序列的基因片段作为模板通过PCR制备。另外地，本领域普通技术人员可以根据诸如探针的长度等因素按需调节洗涤溶液的温度和盐浓度。如本文所使用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。通过本领域已知的技术可以确定序列之间从一部分至另一部分的同源性。例如，可以通过使用能够比对序列信息的容易获得的计算机程序直接比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间的序列信息——诸如包括分数、同一性、相似性等的参数(例如，BLAST2.0)——确定同源性。另外地，可以通过在其中多核苷酸可以在同源区域之间形成稳定双链的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有O‑乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽，其中从由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的多肽的N‑末端的第196位氨基酸缬氨酸被苏氨酸取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.13 KR 10-2015-01430351.一种具有O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的修饰的多肽，其中从由SEQIDNO:1的氨基酸序列表示的多肽的N-末端的第196位氨基酸缬氨酸被苏氨酸取代。2.一种编码权利要求1所述的修饰的多肽的多核苷酸。3.一种包括权利要求2所述的多核苷酸的载体。4.一种产生O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的埃希氏菌属的微生物，其中所述微生物表达具...

【专利技术属性】
技术研发人员：李任相，孙晟光，柳惠连，李在熙，李周姬，张真淑，崔珍根，金素影，申容旭，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR