贝壳杉烯酸羟化酶制造技术

本发明专利技术涉及具有贝壳杉烯酸13‑羟化酶活性的变体多肽，所述变体多肽包含氨基酸序列，当与包含SEQ ID NO:1所示序列的贝壳杉烯酸13‑羟化酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于以下位置处的任何氨基酸的氨基酸残基的至少一个替换：72、85、108、127、129、141、172、195、196、197、199、226、236、291、302、361或464，所述位置是参照SEQ ID NO:1限定的，并且其中所述变体与具有贝壳杉烯酸13‑羟化酶活性的参照多肽相比具有一种或多种改变的性质。本发明专利技术的变体多肽可用于重组宿主中以生产甜菊醇或甜菊醇糖苷。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】贝壳杉烯酸羟化酶领域本专利技术涉及具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的变体多肽和包含编码所述多肽的序列的核酸。本专利技术还涉及包含所述核酸的核酸构建体和包含所述核酸或核酸构建体的表达载体。此外，本专利技术涉及包含所述核酸、核酸构建体或表达载体的重组宿主。本专利技术还涉及制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括发酵重组宿主，还涉及通过所述方法能够获得的发酵液以及通过所述方法获得的甜菊醇糖苷或从所述发酵液获得的甜菊醇糖苷。另外，本专利技术涉及包含两种或更多种甜菊醇糖苷的组合物，以及包含所述甜菊醇糖苷或组合物的食品、饲料或饮料。此外，本专利技术涉及将第一甜菊醇糖苷转化成第二甜菊醇糖苷的方法以及生产具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的变体多肽的方法。背景多年生草本植物甜叶菊(SteviarebaudianaBert.)的叶子积聚大量被称为甜菊醇糖苷的具有强烈甜味的化合物。虽然这些化合物的生物功能尚不清楚，但它们作为替代性高效甜味剂具有商业意义。这些甜的甜菊醇糖苷的功能和感官特性表现为优于许多高效甜味剂的功能和感官特性。此外，研究表明甜菊苷能够降低II型糖尿病患者的血糖水平，并且能够降低轻度高血压患者的血压。甜菊醇糖苷积聚在甜叶菊叶中，其中它们可占叶干重的10％至20％。甜菊苷和莱鲍迪甙A均是热和pH稳定的，并且适用于碳酸饮料并且可应用于许多其他食物中。甜菊苷比蔗糖甜110与270倍之间，莱鲍迪甙A比蔗糖甜150与320倍之间。此外，莱鲍迪甙D也是在甜叶菊叶中积聚的高效二萜糖苷甜味剂。它可比蔗糖甜约200倍。莱鲍迪甙M是另一种高效二萜糖苷甜味剂。它在某些甜叶菊品种叶中以痕量存在，但已表明其具有优异的味道特征。传统上已从甜叶菊植物中提取了甜菊醇糖苷。在甜叶菊中，(-)-贝壳杉烯酸(赤霉酸(GA)生物合成中的中间体)被转化成四环二萜甜菊醇，其然后通过多步糖基化途径进行以形成各种甜菊醇糖苷。然而，产率可以是可变的，并且受到农业和环境条件的影响。此外，甜叶菊种植需要大量的土地面积、在收获前的很长时间、密集劳动以及用于提取和纯化糖苷的额外成本。最近，使用发酵工艺生产甜菊醇糖苷的兴趣日益增长。WO2013/110673和WO2015/007748中描述了可用于产生至少甜菊醇糖苷莱鲍迪甙A和莱鲍迪甙D的微生物。此类微生物的进一步改进是令人希望的，以便可产生更高量的甜菊醇糖苷和/或另外或新的甜菊醇糖苷和/或更高量的特定甜菊醇糖苷和/或具有期望比例的不同甜菊醇糖苷的甜菊醇糖苷的混合物。概述本专利技术基于变体贝壳杉烯酸13-羟化酶的鉴定。这些变体可用于产生适用于生产甜菊醇和/或一种或多种甜菊醇糖苷的重组宿主。这种重组宿主与表达非变体贝壳杉烯酸13-羟化酶的重组宿主相比可产生更高量的甜菊醇糖苷和更低量的非期望产物。产生更高量的甜菊醇糖苷和/或更低量的非期望产物可使甜菊醇糖苷的回收更容易。而且，可以获得更高的产率。因此，本专利技术涉及具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的变体多肽，所述变体多肽包含这样的氨基酸序列，当与包含SEQIDNO:1所示序列(来自A.thaliana的野生型KAH序列)的贝壳杉烯酸13-羟化酶比对时，所述氨基酸序列包含对应于以下位置处的任何氨基酸的氨基酸残基的至少一个替换：72、85、108、127、129、141、172、195、196、197、199、226、236、291、302、361或464所述位置是参照SEQIDNO:1限定的，并且其中所述变体与具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的参照多肽相比具有一种或多种改变的性质。本专利技术还涉及：-具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的变体多肽，其包含与SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37具有至少约95％序列同一性，至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列；-包含编码本专利技术多肽的序列的核酸；-包含本专利技术所述核酸的核酸构建体，所述核酸与能够指导贝壳杉烯酸13-羟化酶在合适表达宿主中表达的一种或多种控制序列可操作地连接；-包含根据本专利技术的核酸或核酸构建体的表达载体；-包含本专利技术的核酸、核酸构建体或表达载体的重组宿主；-一种制备甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵根据权利要求11-19中任一项所述的重组宿主，和任选地，回收甜菊醇或甜菊醇糖苷；-包含通过本专利技术的方法能够获得的甜菊醇糖苷的发酵液；-通过本专利技术的方法获得的或从本专利技术的发酵液获得的甜菊醇糖苷；-组合物，其包含两种或更多种通过本专利技术的方法获得的或从本专利技术的发酵液获得的甜菊醇糖苷；-食品、饲料或饮料，其包含本专利技术的甜菊醇糖苷或本专利技术的组合物；-一种将第一甜菊醇糖苷转化成第二甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括：使所述第一甜菊醇糖苷与本专利技术的重组宿主、来源于所述重组宿主的无细胞提取物或来源于二者之一的酶制品接触；从而将所述第一甜菊醇糖苷转化为所述第二甜菊醇糖苷；和-一种生产贝壳杉烯酸13-羟化酶的方法，所述方法包括：在适于生产贝壳杉烯酸13-羟化酶的条件下培养本专利技术的宿主细胞，和任选地，回收所述贝壳杉烯酸13-羟化酶。附图简介图1和图2示出了导致甜菊醇糖苷生物合成的潜在通路的示意图。图3示出了克隆到含有INT3整合侧翼(其允许在Y.lipolytica中进行同源重组)以及KAH4和HygB(编码潮霉素抗性)的启动子-开放阅读框-终止子的载体中的KAH4基因变体的质粒图谱。序列表描述SEQIDNO:1示出了来自Arabidopsisthaliana的贝壳杉烯酸13-羟化酶多肽的氨基酸序列。SEQIDNO:2示出了编码来自Arabidopsisthaliana的贝壳杉烯酸13-羟化酶多肽的核苷酸序列，其针对在Yarrowialipolitica中表达进行了密码子对优化。SEQIDNO:3示出了KAH4_m4多肽的氨基酸序列。SEQIDNO:4示出了编码KAH4_m4多肽的核苷酸序列，其针对在Yarrowialipolitica中表达进行了密码子对优化。表5中描述了SEQIDNO:5-38。SEQIDNO:39示出了编码来自Yarrowialipolitica的羟甲基戊二酰基-CoA还原酶多肽的核苷酸序列，其针对在Yarrowialipolitica中表达进行了密码子对优化。SEQIDNO:40示出了编码来自Yarrowialipolitica的香叶基香叶基二磷酸合酶多肽的核苷酸序列，其针对在Yarrowialipolitica中表达进行了密码子对优化。SEQIDNO:41示出了编码来自Mucorcircenelloides的香叶基香叶基二磷酸合酶多肽的核苷酸序列，其针对在Yarrowialipolitica中表达进行了密码子优化。SEQIDNO:42示出了编码来自Steviarebaudiana的柯巴基焦磷酸合酶多肽的核苷酸序列，其针对在Yarrowialipolitica中表达进行了密码子对优化。SEQIDNO:43示出了编码来自Steviarebaudiana的贝壳杉烯合酶多肽的核苷酸序列，其针对在Yarrowialipolitica中表达进行了密码子对优化。SEQIDNO:44示出了编码来自Giberellafujik本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有贝壳杉烯酸13‑羟化酶活性的变体多肽，所述变体多肽包含氨基酸序列，当与包含SEQ ID NO:1所示序列的贝壳杉烯酸13‑羟化酶比对时，所述氨基酸序列包含至少一个对应于以下位置处的任何氨基酸的氨基酸残基的替换：72、85、108、127、129、141、172、195、196、197、199、226、236、291、302、361或464所述位置是参照SEQ ID NO:1限定的，并且其中所述变体与具有贝壳杉烯酸13‑羟化酶活性的参照多肽相比具有一种或更多种改变的性质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.09 EP 16183457.7;2015.10.05 US 62/237,2031.具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的变体多肽，所述变体多肽包含氨基酸序列，当与包含SEQIDNO:1所示序列的贝壳杉烯酸13-羟化酶比对时，所述氨基酸序列包含至少一个对应于以下位置处的任何氨基酸的氨基酸残基的替换：72、85、108、127、129、141、172、195、196、197、199、226、236、291、302、361或464所述位置是参照SEQIDNO:1限定的，并且其中所述变体与具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的参照多肽相比具有一种或更多种改变的性质。2.根据权利要求1所述的变体多肽，其中所述改变的性质是改变的贝壳杉烯酸13-羟化酶活性。3.根据权利要求1或2所述的变体多肽，其中所述参照多肽包含SEQIDNO:1的贝壳杉烯酸13-羟化酶。4.根据前述权利要求中任一项所述的变体多肽，其中所述变体多肽是非天然存在的多肽。5.根据前述权利要求中任一项所述的变体多肽，其除权利要求1中限定的那些替换之外还包含额外的替换。6.根据前述权利要求中任一项所述的变体多肽，其与SEQIDNO:1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。7.具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的变体多肽，其包含与SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37之任一具有至少约95％序列同一性、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。8.核酸，其包含编码根据前述权利要求中任一项所述的多肽的序列。9.核酸构建体，其包含权利要求8所述的核酸序列，所述核酸序列与能够指导贝壳杉烯酸13-羟化酶在合适表达宿主中表达的一种或更多种控制序列可操作地连接。10.表达载体，其包含根据权利要求8的核酸或根据权利要求9的核酸构建体。11.重组宿主，其包含根据权利要求8的核酸、根据权利要求9的核酸构建体或根据权利要求10的表达载体。12.根据权利要求11所述的重组宿主，其能够产生甜菊醇或甜菊醇糖苷。13.根据权利要求11或12所述的重组宿主，其包含一种或更多种编码以下多肽的重组核苷酸序列：具有对映-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；具有对映-贝壳杉烯合酶活性的多肽；和具有对映-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；以及任选地具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，其不同于根据权利要求1-7中任一项所述的变体多肽。14.根据权利要求11-13中任一项所述的重组宿主，其包含编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的重组核酸序列。15.根据权利要求1-14中任一项所述的重组宿主，其包含编码以下项中的一种或更多种的重组核酸序列：(i)具有UGT74G1活性的多肽；(ii)具有UGT2活性的多肽；(iii)具有UGT85C2活性的多肽；和(iv)具有UGT76G1活性的多肽。16.根据权利要求11-15中任一项所述的重组宿主，其中所述宿主属于S...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰尼斯·古斯塔夫·恩斯特·范·莱文，普利斯希勒·扎尔特简斯，维克托·马里厄斯·波尔，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL