细胞培养制造技术

描述了一种分离的3维肝球状体，其中所述球状体具有：与在单独完全William's E培养基中培养的3维肝球状体相比增加的ATP含量；与在单独完全William's E培养基中培养的3维肝球状体相比相同或增加的细胞色素P450 1A1和细胞色素P450 1B1活性；以及与在单独William's E培养基中培养的3维肝球状体相比增加的白蛋白分泌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞培养
本专利技术涉及细胞培养领域，具体地说，涉及3维细胞培养、3维共培养物和其方法和用途。
技术介绍
使用2维细胞培养系统的毒理学研究已经用于检验药物对细胞存活和酶活性的作用等。虽然使细胞在塑料表面上呈平坦层生长是简明易懂的并且允许对细胞生理学和对刺激的反应的若干方面进行研究，但其未能反映出器官的实际结构和构造。在2维单层中，胞外基质、细胞与细胞和细胞与基质的相互作用消失，这些相互作用是分化、增殖和细胞功能必不可少的。3维培养系统可以形成特征与在体内观测到的特征类似的功能组织。与2维培养系统相比，3维细胞培养允许细胞在所有三个维度上与其周围环境相互作用，并且在生理学上更加相关。此类细胞展示存活力、增殖、分化、形态、对刺激的反应、药物代谢、基因表达和蛋白质合成等方面有所改善。3维细胞培养能够产生特定的组织样结构并且以比传统的2维细胞单层在生理学上更加相关的方式模拟实际组织的功能和反应。可以购得若干模拟人类器官的3维组织。举例而言，肺3维器官型组织可以使用在空气-液体界面(ALI)生长的原代人类细胞制备，在空气-液体界面中这些细胞将分化并形成功能组织。这些3维组织具有与人类支气管组织密切的形态相似性和代谢特征。其由布置成假复层结构的基底细胞、杯状细胞和纤毛细胞构成。与肺类似，存在积极摆动的纤毛，允许研究其功能和活性。与人类肺相比，已经在这些3维ALI培养物中发现类似水平的编码异生物质酶的mRNA。另外，这些组织可以在体外长时间维持。这种肺组织的3维模型是一种适于探索气溶胶和药物等的作用以及观测重复暴露的作用的模型。也已经描述了其它的3维模型，包含3维肝脏球形模型。肝球状体可以由最初在2维培养物中用于确定药物处理对肝细胞的作用的若干细胞类型构成。然而，尽管与人类肝脏组织相比，1期代谢基因表达类似，但原代人类肝细胞表达代谢酶不超过5天。另一限制是存活力短，这使得重复给药有困难。这些缺点可以通过使用替代的长期存活的肝脏细胞系，例如HepaRG细胞(ThermoFisherScientific)来克服。HepaRG细胞是一种保留原代人类肝细胞的许多特征的人类肝祖细胞系。其肝脏特异性和1期代谢基因表达比原代肝细胞大。另外，其使用寿命大大增加。3维球状体中HepaRG细胞的形成增加了使用寿命和代谢能力。对与肝脏相关的毒理学研究的关注涉及这个组织通过异生物质代谢来代谢若干化合物的能力。虽然许多化合物不活化并且溶解，但一些被生物活化并且因此变得有毒。因此，在不考虑肝脏中发生的生物活化过程下在器官中研究化合物的毒性可能会低估测试物质的毒性作用。因此，在气溶胶暴露领域中，需要一种改良的方法来研究物质在肺中的渗透和其在肝脏中的进一步生物活化。本专利技术力图解决所属领域中的这一需要。
技术实现思路
在本公开中，已经建立个别的肺和肝培养物，并且在形态上和功能上进行表征。为了促进两种细胞类型的共培养，已经鉴别出使得肺与肝培养物维持存活力、结构完整性和功能的细胞培养条件以及特别是细胞培养基。有利的是，这使得有可能研发出多器官系统，这种系统重建肺与肝之间的相互关系，并且值得注意的是，不损失每个细胞个别特征。本文中的发现是完全意外的，即肺上皮细胞培养基可以用于成功地生长和维持肝球状体并且更值得注意的是，可以改善肝球状体的特征。使用这种多器官系统将大大有助于了解肝对如气溶胶等经肺吸收的化合物的代谢的作用。本公开提供了一种有用的工具来研究化合物在3维细胞培养系统中的影响，所述系统更接近临床情况,因此预期其更能预测，并提供一种独特、简单和廉价的3维肝和肺细胞共培养系统。本专利技术的方面和实施例在第一方面中，提供了一种分离的3维肝球状体，其中所述球状体具有：与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，增加的ATP含量；与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，相同或增加的细胞色素P4501A1和细胞色素P4501B1活性；以及与在单独William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，增加的白蛋白分泌。术语“单独完全William'sE培养基”意指仅仅由完全William'sE培养基组成的培养基，即由100％(v/v)完全William'sE培养基组成的培养基。在另一方面中，提供了一种分离的3维肝球状体，其用于3维多器官培养系统中，所述系统通过或可通过以下方法获得，所述方法包括：在包括以下或由以下组成或基本上由以下组成的细胞培养基中培养3维肝球状体：(a)完全PneumaCult-ALI培养基；或(b)完全B-ALI培养基；或(c)完全PneumaCult-ALI培养基和完全William'sE培养基或(d)完全B-ALI培养基和完全William'sE培养基，历时足以获得如下3维肝球状体的时间，其中：与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，ATP含量增加；与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，细胞色素P4501A1和细胞色素P4501B1活性相同或有所增加；并且与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，白蛋白分泌有所增加。适当地，球状体是或来源于人类肝祖细胞系，适当地，其中球状体是或来源于HepaRG细胞。适当地，球状体在包括以下或由以下组成或基本上由以下组成的细胞培养基中培养：(a)完全PneumaCult-ALI培养基；或(b)完全B-ALI培养基；(c)完全PneumaCult-ALI培养基和完全William'sE培养基或(d)完全B-ALI培养基和完全William'sE培养基。在另一方面中，提供了一种共培养物，其包括根据前述权利要求项中任一项所述的3维肝球状体和3维肺上皮细胞。适当地，共培养物维持在包括以下或由以下组成或基本上由以下组成的细胞培养基中：(a)完全PneumaCult-ALI培养基；或(b)完全B-ALI培养基；或(c)完全PneumaCult-ALI培养基和完全William'sE培养基或(d)完全B-ALI培养基和完全William'sE培养基。在另一方面中，提供了3维器官培养系统，其包括本文所述的分离的3维肝球状体。在另一方面中，提供了一种3维多器官培养系统，其包括如本文所述的分离的3维肝球状体并且进一步包括至少一种其它3维细胞类型或包括本文所述的共培养物。适当地，3维肝球状体被浸没在培养系统上所含有的培养基中。适当地，3维多器官培养系统进一步包括3维肺上皮细胞，适当地，其中3维肺上皮细胞在3维多器官培养系统上的空气液体界面处。在另一方面中，提供了一种3维多器官培养系统，包括：(a)第一器官生长部分，其包括被调适成用于将第一3维细胞类型浸没在培养基中的第一器官腔；(b)第二器官生长部分，其包括被调适成用于将第二3维细胞类型在空气液体界面处培养的第二器官腔，所述第二3维细胞类型是与所述第一3维细胞类型不同的细胞类型；以及(c)将第一器官腔和第二器官腔连接以允许培养基在两者之间流动的培养基储集器。适当地，第一器官腔和第二器官腔含有相同的培养基。适当地，3维多器官培养系统包括本文所述的共培养物。适当地，使3维器官培养系统或3维多器官培养系统小型化。适当地，3维器官培养系统或3维多器官培养系统包括或是微流体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的3维肝球状体，其中所述球状体具有：与在单独完全William's E培养基中培养的3维肝球状体相比增加的ATP含量；与在单独完全William's E培养基中培养的3维肝球状体相比相同或增加的细胞色素P450 1A1和细胞色素P450 1B1活性；以及与在单独William's E培养基中培养的3维肝球状体相比增加的白蛋白分泌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.25 EP 16185725.51.一种分离的3维肝球状体，其中所述球状体具有：与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比增加的ATP含量；与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比相同或增加的细胞色素P4501A1和细胞色素P4501B1活性；以及与在单独William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比增加的白蛋白分泌。2.一种用于3维多器官培养系统中的分离的3维肝球状体，所述系统通过或可通过如下方法获得，所述方法包括：将3维肝球状体在包括以下或由以下组成或基本上由以下组成的细胞培养基中培养：(a)完全PneumaCult-ALI培养基；或(b)完全B-ALI培养基；或(c)完全PneumaCult-ALI培养基和完全William'sE培养基或(d)完全B-ALI培养基和完全William'sE培养基，历时足以获得如下3维肝球状体的时间，其中：与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，ATP含量增加；与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，细胞色素P4501A1和细胞色素P4501B1活性相同或有所增加；以及与在单独完全William'sE培养基中培养的3维肝球状体相比，白蛋白分泌有所增加。3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的3维肝球状体，其中所述球状体是或来源于人类肝祖细胞系，适当地，其中所述球状体是或来源于HepaRG细胞。4.根据权利要求1或权利要求3所述的分离的3维肝球状体，其中所述球状体在包括以下或由以下组成或基本上由以下组成的细胞培养基中培养：(a)完全PneumaCult-ALI培养基；或(b)完全B-ALI培养基；(c)完全PneumaCult-ALI培养基和完全William'sE培养基或(d)完全B-ALI培养基和完全William'sE培养基。5.一种共培养物，其包括根据前述权利要求中任一项所述的3维肝球状体和3维肺上皮细胞，优选地，其中所述共培养物维持在包括以下或由以下组成或基本上由以下组成的细胞培养基中：(a)完全PneumaCult-ALI培养基；或(b)完全B-ALI培养基；或(c)完全PneumaCult-ALI培养基和完全William'sE培养基或(d)完全B-ALI培养基和完全William'sE培养基。6.一种3维器官培养系统或一种3维多器官培养系统，所述3维器官培养系统包括根据权利要求1至4中任一项所述的分离的3维肝球状体，所述3维多器官培养系统包括根据权利要求1至4中任一项所述的分离的3维肝球状体并且进一步包括至少一种其它3维细胞类型，或包括根据权利要求5所述的共培养物，优选地，其中所述3维肝球状体被浸没在所述培养系统上所含有的培养基中；和/或进一步包括3维肺上皮细胞，适当地，其中所述3维肺上皮细胞在所述3维多器官培养系统上的空气液体界面处。7.一种3维多器官培养系统，其包括：(a)第一器官生长部分，其包括被调适成用于将第一3维细胞类型浸没在培养基中的第一器官腔；(b)第二器官生长部分，其包括被调适成用于将第二3维细胞类型在空气液体界面处培养的第二器官腔，所述第二3维细胞类型是与所述第一3维细胞类型不同的细胞类型；以及(c)将所述第一器官腔和所述第二器官腔连接以允许培养基在两者之间流动的培养基储集器；优选地，其中所述第一器官腔和所述第二器官腔含有相同的培养基；和/或其进一步包括根据权利要求5所述的共培养物；和/或其中所述系统小型化；和/或其中所述系统包括或是微流体装置，适当地，其中所述系统是芯片上器官。8.一种细胞培养基，其包括以下或由以下组成或基本上由以下组成：(a)完全PneumaCult-ALI培养基与完全William'sE培养基的混合物；或(b)完全B-ALI培养基与完全William'sE培养基的混合物；优选地，其进一步包括根...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·博瓦德，K·吕蒂希，
申请(专利权)人：菲利普莫里斯生产公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH