具有改善性质的凝乳酶的变体制造技术

具有改善的αS1‑酪蛋白裂解和C/P性质的凝乳酶的变体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改善性质的凝乳酶的变体
本专利技术涉及具有改善的αS1-酪蛋白和C/P裂解性质的凝乳酶的变体。
技术介绍
凝乳酶(EC3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC3.4.23.1)是哺乳动物胃的乳凝固酶，它们是属于肽酶大类的天冬氨酸蛋白酶。当在胃粘膜细胞中产生时，凝乳酶和胃蛋白酶分别作为无酶活性的凝乳酶原前体(pre-prochymosin)和胃蛋白酶原前体(pre-pepsinogen)存在。当凝乳酶被分泌时，N端肽片段、即前片段(pre-fragment)(信号肽)被裂解掉，产生包括原片段(pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是一种基本无活性形式的酶，然而，它在酸性条件下通过自动催化去除原片段而被活化成活性凝乳酶。这种活化在适当的pH条件下体内发生在胃腔内或在酸性条件下体外发生。已经广泛研究了牛(bovine)(即牛(Bostaurus))凝乳酶原前体、凝乳酶原和凝乳酶的结构和功能特征。牛凝乳酶原前体分子的前部分(pre-part)包含16个氨基酸残基，并且相应的凝乳酶原的原部分(pro-part)具有42个氨基酸残基的长度。活性牛凝乳酶包含323个氨基酸。凝乳酶在例如牛、骆驼、山羊、水牛、绵羊、猪、人、猴子和大鼠的哺乳动物物种中自然产生。牛和骆驼凝乳酶已经在乳品业中商业化数年之久。乳凝固酶如凝乳酶和胃蛋白酶对乳的酶促凝结是奶酪制造中最重要的过程之一。酶促乳凝结是一个两阶段过程：第一阶段，其中蛋白水解酶(凝乳酶或胃蛋白酶)攻击κ-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态，和第二阶段，其中乳随后凝结并形成凝结物(参考文献1)。除了通过裂解κ-酪蛋白而促进乳凝结之外，凝乳酶还主要在Phe23和Phe24之间裂解αS1-酪蛋白(alphaS1-casein/αS1-casein)(Moynihan等人2014)，导致形成αS1(1-23)肽。已经描述了αS1(1-23)肽的形成有助于软化奶酪质地(Creamer&Olsen,1982)。例如，比较来自牛和单峰驼(Camelusdromedarius)的凝乳酶，已经发现了两个参数的相关性。虽然牛凝乳酶与骆驼凝乳酶相比在Phe23和Phe24之间更快地裂解αS1酪蛋白(Creamer&Olsen,1982；Bansal等人2009)，但是它产生更软的奶酪且奶酪的质地分解(texturebreak-down)更高，例如切达奶酪(cheddar)(Creamer&Olsen,1982；Bansal等人2009)和马苏里拉奶酪(mozzarella)(Moynihan等人2014)。获得具有不同程度的αS1(1-23)肽形成的奶酪凝结剂可以使奶酪制造商能够对奶酪基质施加不同水平的柔软度。因此，具有增加或减少的αS1(1-23)肽形成的凝乳酶变体在奶酪制造中具有很高的工业利益。具有精细调节的αS1-酪蛋白蛋白水解作用的凝结剂将有助于制造各种具有最佳凝块硬度(curdfirmness)的奶酪类型。下面列出的参考文献在本文中可被看作是描述凝乳酶突变体的参考文献：-WO02/36752A2(Chr.Hansen)描述了骆驼凝乳酶的重组生产。-WO2013/174840A1(Chr.Hansen)描述了牛和骆驼凝乳酶的突变体/变体。-WO2013/164479A2(DSM)描述了牛凝乳酶的突变体。-Suzuki等人：定点诱变揭示了Thr218、Lys220和Asp304在凝乳酶中的功能贡献(SitedirectedmutagenesisrevealsfunctionalcontributionofThr218,Lys220andAsp304inchymosin),蛋白质工程(ProteinEngineering),第4卷,1990年1月,第69-71页；-Suzuki等人：定点诱变对凝乳酶的催化性质的改变(Alterationofcatalyticpropertiesofchymosinbysite-directedmutagenesis),蛋白质工程(ProteinEngineering),第2卷,1989年5月,第563-569页；-vandenBrink等人：通过糖基化而增加的凝乳酶的产生(Increasedproductionofchymosinbyglycosylation),生物技术杂志(Journalofbiotechnology),第125卷,2006年9月,第304-310页；-Pitts等人：在里氏木霉中产生的凝乳酶pH最适突变体的表达和表征(ExpressionandcharacterisationofchymosinpHoptimamutantsproducedinTrichodermareesei),生物技术杂志(Journalofbiotechnology),第28卷,1993年3月,第69-83页；-M.G.Williams等人：牛凝乳酶的点突变体的诱变、生物化学表征和X射线结构分析(Mutagenesis,biochemicalcharacterizationandX-raystructuralanalysisofpointmutantsofbovinechymosin),蛋白质工程设计和选择(Proteinengineeringdesignandselection),第10卷,1997年9月,第991-997页；-Strop等人：工程设计酶亚位点特异性：Val111phe位点突变的小牛凝乳酶的制备、动力学表征和在2.0ANG分辨率下的x射线分析(Engineeringenzymesubsitespecificity:preparation,kineticcharacterization,andx-rayanalysisat2.0ANGresolutionofVal111phesitemutatedcalfchymosin),生物化学(Biochemistry),第29卷,1990年10月,第9863-9871页；-Chitpinityol等人：影响凝乳活性的小牛凝乳酶B的位点特异性突变(Site-specificmutationsofcalfchymosinBwhichinfluencemilk-clottingactivity),食品化学(FoodChemistry),第62卷,1998年6月,第133-139页；-Zhang等人：重组凝乳酶原中的二硫键Cys45-Cys50的功能影响(Functionalimplicationsofdisulfidebond,Cys45-Cys50,inrecombinantprochymosin),生物化学与生物物理学报(Biochimicaetbiophysicaacta),第1343卷,1997年12月,第278-286页。以上提到的现有技术参考文献都没有直接、明确地描述如下所述的任何凝乳酶变体，所述凝乳酶变体与衍生其的亲本相比具有改变的αS1-酪蛋白裂解频率和提高的C/P值。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供凝乳酶变体，其与亲本多肽相比时具有更低或更高的αS1-酪蛋白裂解频率和增加的C/P值。通过专注的努力并通过应用多维研究策略，诸位专利技术人发现了允许设计分离的凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于：(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1‑酪蛋白的频率低于由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1‑酪蛋白裂解频率的80％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1‑酪蛋白肽来确定αS1‑酪蛋白裂解，其中通过与ESI‑Q‑TOF质谱仪偶联的RP‑HPLC进行定量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.31 EP 15183205.21.一种分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于：(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQIDNO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率低于由SEQIDNO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的80％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。2.根据权利要求1所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中亲本多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％，例如至少例如80％、85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。3.根据权利要求1或2所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQIDNO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L和/或V317L。4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含以下取代的组合中的一个或多个，并且其中每个取代相对于SEQIDNO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：Y21S+H76Q+Y307F+V317L、R61S+L166V+T239S、V32L+E294Q+R316L+V317L、S226T+G244D+I263L+G289S、V203A+V248I+G251W+L253I+Y268F、D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S、D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E、D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T、D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A、L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I、L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D、L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D、L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I、L12M+K19T+D59N+H76Q+S154A+M165E+V198I+L222I+G251D、L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W、V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T、L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P、D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D、H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、H76Q+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、K19T+D59N+H76Q+S164G+L222I+N249D+S273Y、H76Q+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、H76Q+I96L+S164G+G251D+S273Y+V309I、K19T+D59N+H76Q+S164G+R242E+N249D+G251D+S273Y、Y21S+D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309ID59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y、H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y、D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I、D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E、K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I、D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I、D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y、Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y、D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y、D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I、K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y、K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y、Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I、K19T+D59N+H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y、D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y、H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D、D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y、K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I、H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y、Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y、Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D、Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L、Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L、K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D、H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D、Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I、K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L、Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V、I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V、K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+I263V、K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I、I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L、K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I、D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L、K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V、K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I、K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D、K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V、K19T+I96L+S164G+R242E+L253I、K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L、K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+I263V、I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L、K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D、K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D、Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D、K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I、H76Q+N100Q+N291Q、R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q、V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L、R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I、Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E、R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H、Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·杰克尔，马丁·伦德，E·F·汉森，L·里斯伯格，伊本·杰普森，约翰尼斯·马腾·范丹尼布林克，
申请(专利权)人：科汉森有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK