一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物制造技术

本发明专利技术提供了一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，该技术方案选择eae基因作为细菌黏附素表达基因，首先构建了共表达犬α干扰素及细菌黏附素的重组载体，并以原核表达系统表达，产物经GST亲和层析纯化后得到犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白，从而实现了犬α干扰素在人消化道内的靶向性，增加了肠上皮细胞局部干扰素浓度和作用时间。口服该融合蛋白可显著提升犬α干扰素的治疗效果并延长药效时间，对犬细小病毒病的治疗具有积极的促进作用。

A therapeutic drug used for canine viral diarrhea

The invention provides a therapeutic drug for canine viral diarrhea. The technical scheme selects the EAE gene as a bacterial adhesion gene expression gene, first constructs a recombinant vector that CO expresses canine interferon and bacterial adhesion, and expresses it in the prokaryotic expression system. The product is purified by GST affinity and chromatograph to obtain canine interferon and fine. The fusion protein of bacterial adherent has achieved the targeting of interferon in the human digestive tract, increasing the concentration of interferon in the intestinal epithelial cells and the time of action. Oral fusion protein can significantly enhance the therapeutic efficacy and prolong the efficacy time of canine interferon alpha, and it has a positive effect on the treatment of canine parvovirus disease.

【技术实现步骤摘要】
一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物
本专利技术涉及兽用生物制品
，具体涉及一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物。
技术介绍
犬细小病毒，属细小病毒科，是一种无囊膜的单股DNA病毒。该病毒可通过饲料、粪便等传播，以剧烈呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特征，幼犬深受其害，可引发出血性肠炎或急性心肌炎(以感染肠上皮细胞居多)，死亡率可达到50％～80％。目前，治疗犬细小病毒病的方法主要是疫苗免疫、抗体紧急治疗，及干扰素的辅助治疗。目前犬干扰素以α型为主，报道多见于注射剂，但常由于胃肠局部抗体滴度不够，导致隐形带毒甚至排毒。而滴鼻、口服剂贴近天然感染，但由于在给药剂量难精确、体内存留时间短等缺点效果也并不理想。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，以解决现有技术中干扰素口服给药不具有靶向性，因而吸收效果较差的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是如何提升口服犬α干扰素对犬细小病毒病的治疗效果。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，该药物是通过以下方法制备的：1)构建含有ChIFNα-linker-eae载体的重组大肠杆菌；2)培养所述重组大肠杆菌，取菌体裂解，取上清液经GST亲和层析，即得到犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白原液；3)取所述犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白原液，加入等体积的，含有1～2％(w/w)多聚葡萄糖、5～10％(w/w)甘露醇的冻干保护剂，冻干得到产物。作为优选，步骤1)具体包括以下操作：根据GeneBank中FJ788637的mRNA序列设计引物，同时分别在引物的5’端引入NcoI酶切位点，3’端引入HindIII酶切位点；以合成的基因序列为模板、引物进行PCR扩增，使用DNA回收试剂盒回收PCR产物，用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切已回收的PCR扩增产物，得到酶切产物；用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切表达载体pET-28a(+)，利用DNA回收试剂盒回收载体骨架；用T4DNA连接酶16℃连接过夜，即得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性的菌落，即得到含有ChIFNα-linker-eae载体的重组大肠杆菌。作为优选，步骤1)中设计引物前，先根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对所述FJ788637的mRNA序列进行稀有密码子的替换并调节GC含量，以修饰后的序列设计引物。作为优选，步骤3)具体包括以下操作：取步骤2)所得的融合蛋白原液以及含有1～2％(w/w)多聚葡萄糖、5～10％(w/w)甘露醇的冻干保护剂各100ml，混匀后以1～2mL/支的装量分装；分装后的混合物置于冻干箱隔板上，降温至-40℃保持1～2h，而后启动真空泵，当冻干箱内的真空度达10Pa以上，关闭冷冻机，通过隔板加热，以升3～5℃/小时的升温速度升温至-15℃保持10h；以5℃/小时的升温速度升温至-5℃保持120分钟，而后以5℃/小时的升温速度升温至25℃保持2～3h，即得到冻干产物。本专利技术提供了一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，该技术方案选择eae基因作为细菌黏附素表达基因，首先构建了共表达犬α干扰素及细菌黏附素的重组载体，并以原核表达系统表达，产物经GST亲和层析纯化后得到犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白，从而实现了犬α干扰素在人消化道内的靶向性，增加了肠上皮细胞局部干扰素浓度和作用时间。口服该融合蛋白可显著提升犬α干扰素的治疗效果并延长药效时间，对犬细小病毒病的治疗具有积极的促进作用。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。实施例1一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，该药物是通过以下方法制备的：1)构建含有ChIFNα-linker-eae载体的重组大肠杆菌；2)培养所述重组大肠杆菌，取菌体裂解，取上清液经GST亲和层析，即得到犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白原液；3)取所述犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白原液，加入等体积的，含有1～2％(w/w)多聚葡萄糖、5～10％(w/w)甘露醇的冻干保护剂，冻干得到产物。其中，步骤1)具体包括以下操作：根据GeneBank中FJ788637的mRNA序列设计引物，同时分别在引物的5’端引入NcoI酶切位点，3’端引入HindIII酶切位点；以合成的基因序列为模板、引物进行PCR扩增，使用DNA回收试剂盒回收PCR产物，用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切已回收的PCR扩增产物，得到酶切产物；用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切表达载体pET-28a(+)，利用DNA回收试剂盒回收载体骨架；用T4DNA连接酶16℃连接过夜，即得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性的菌落，即得到含有ChIFNα-linker-eae载体的重组大肠杆菌。步骤3)具体包括以下操作：取步骤2)所得的融合蛋白原液以及含有1～2％(w/w)多聚葡萄糖、5～10％(w/w)甘露醇的冻干保护剂各100ml，混匀后以1～2mL/支的装量分装；分装后的混合物置于冻干箱隔板上，降温至-40℃保持1～2h，而后启动真空泵，当冻干箱内的真空度达10Pa以上，关闭冷冻机，通过隔板加热，以升3～5℃/小时的升温速度升温至-15℃保持10h；以5℃/小时的升温速度升温至-5℃保持120分钟，而后以5℃/小时的升温速度升温至25℃保持2～3h，即得到冻干产物。以下通过实验方法验证上述药物对犬细小病毒病的治疗效果。表1本实施例药物在不同给药途径下的治疗效果分组幼犬数量给药途径治愈情况注射组10只肌肉注射，1ml/只，连续注射3天4只治愈口服组10只口服，1ml/只，连续口服3天6只治愈对照组10只对照组8只发病无注：发病判断标准(满足①和②，其中①仅满足A～C中任1项即可)①A潜伏期1周到2周，病出无任何症状，食欲减退或废绝，体温40℃以上，粉红色粘稠血样物；B病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射状，粪便呈红色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样稀便，并有特殊的腥臭味；C患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。②用犬细小病毒试纸条检测，连续3天为阳性。以上实验结果表明，本实施例所制备的药物通过口服方式给药能获得较好的治疗效果，治愈率高于注射方式给药。表2以口服方式给药时犬α干扰素存在形式对治疗效果的影响分组幼犬数量给药途径治愈情况本实施例药物10只肌肉注射，1ml/只，连续注射3天8只治愈单独干扰素组10只口服，1ml/只，连续口服3天6只治愈对照组10只对照组10只发病无以上实验结果表明，本实施例所制备的融合蛋白能有效提升犬α干扰素口服的治疗效果，较单纯犬α干扰素的治愈率更高。实施例2一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，其特征在于该药物是通过以下方法制备的：1)构建含有ChIFNα-linker-eae载体的重组大肠杆菌；2)培养所述重组大肠杆菌，取菌体裂解，取上清液经GST亲和层析，即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，其特征在于该药物是通过以下方法制备的：1)构建含有ChIFNα‑linker‑eae载体的重组大肠杆菌；2)培养所述重组大肠杆菌，取菌体裂解，取上清液经GST亲和层析，即得到犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白原液；3)取所述犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白原液，加入等体积的，含有1～2％(w/w)多聚葡萄糖、5～10％(w/w)甘露醇的冻干保护剂，冻干得到产物。

【技术特征摘要】
1.一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，其特征在于该药物是通过以下方法制备的：1)构建含有ChIFNα-linker-eae载体的重组大肠杆菌；2)培养所述重组大肠杆菌，取菌体裂解，取上清液经GST亲和层析，即得到犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白原液；3)取所述犬α干扰素和细菌黏附素的融合蛋白原液，加入等体积的，含有1～2％(w/w)多聚葡萄糖、5～10％(w/w)甘露醇的冻干保护剂，冻干得到产物。2.根据权利要求1所述的一种用于犬病毒性腹泻的治疗药物，其特征在于步骤1)具体包括以下操作：根据GeneBank中FJ788637的mRNA序列设计引物，同时分别在引物的5’端引入NcoI酶切位点，3’端引入HindIII酶切位点；以合成的基因序列为模板、引物进行PCR扩增，使用DNA回收试剂盒回收PCR产物，用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切已回收的PCR扩增产物，得到酶切产物；用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切表达载体pET-28a(+)，利用DNA回收试剂盒回收载体骨架；用T4DNA连接酶1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李守军，王甜，郁宏伟，杨保收，梁武，苏建东，刘海霞，李蓬飞，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12