一种CRISPR/Cas9随机文库及其构建和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种CRISPR/Cas9随机文库及其构建和应用。所述的CRISPR/Cas9随机文库，其特征在于，包括sgRNA，所述的sgRNA含有识别序列，其中该序列的20个核苷酸第1个设定为G，2至20个设定为随机的核苷酸。本发明专利技术建立了高通量、通用的、无偏好的sgRNA随机文库，提供功能基因组学高通量功能注释基因组功能元件的有效工具。

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR/Cas9随机文库及其构建和应用
本专利技术涉及一种CRISPR/Cas9随机文库及应用。
技术介绍
基因组计划完成后，科学家们进行功能基因组研究面临的挑战之一就是高通量功能注释功能基因元件。RNA干扰是一种有效的高通量功能研究的策略[Kaelin，2012]。不过存在脱靶效应、只是敲降而不是敲除基因、只能影响表达基因不能针对非编码功能元件等因素，限制了其应用。CRISPR/Cas9系统是理想的高通量基因敲除工具，不过已有的sgRNA文库通量非常有限，本专利技术拟研发构建高通量、通用的、无偏好sgRNA随机文库的策略。基因组学研究面临的挑战之一就是功能注释不同基因组功能元件：人类基因组计划表明，在人类大约3x109bp的基因组上，只有大约2～4％的编码区编码20000-25000个基因[ConsortiumIHGS.2004]。各种生命过程，包括发育、增殖、分化、衰老等，都是由编码基因的时空表达调控的，而编码基因的表达通过非编码的基因组调控元件实现(图1)。为此，各国的科学家们成立了ENCODE(EncyclopediaofDNAElements)联盟，联合开展ENCODE计划，通过Tillingarray、Tagsequencing、Genomicsequencing、Promoterassay等技术手段，结合计算分析，以鉴定人类基因组上的功能元件[ENCODEProjectConsortium.2007]。阶段性研究结果表明，人类基因组的80.4％区域分布了百万级别的功能元件，大部分元件的功能尚未注释[ENCODEProjectConsortium.2012]。基因组学研究面临的挑战之一就是高通量功能注释基因组功能元件。CRISPR/Cas9是识别和注释基因组元件的有力工具：CRISPR/Cas9是2012年研发出的一种新型基因组修饰技术--规律成簇的间隔短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)。在这一系统中，sgRNA(singleguidedRNA)通过靶序列互补引导Cas9蛋白定位剪切双链DNA，形成双链DNA缺口，然后借助同源重组机制(homologousrecombination，HR)或者非同源末端连接机制(non-homologousendjoining，NHEJ)对断裂的DNA进行修复。引起靶位点的突变、缺失或插入，造成基因敲除效果，或基因敲入效果[Congetal.，2013；Jineketal.，2012；Malietal.，2013]。由于简便、高效、价廉，该技术出现之后立即席卷全球，成为了基因编辑领域最新，但发展最快、应用最广的技术，引发了基因编辑领域的革命。现在CRISPR/Cas9系统已经被成功地用于DNA敲除、DNA敲入、DNA替代、DNA修饰、RNA修饰、DNA标记、基因转录调节等。CRISPR技术被认为将像PCR技术一样影响生命科学的方方面面[BarrangouandDoudna，2016；Hsuetal.，2014；Ledford.2015]。与其它基因编辑技术不同的是，CRISPR/Cas9由通用的核酸酶Cas9和特异的sgRNA实现靶向，而sgRNA片段小，可以通过同时表达多sgRNA实现多靶点的敲除，使得构建sgRNA文库进行大规模、高通量的功能基因组学研究成为可能[Shalemetal.，2015]。这些特点很快被成功应用于大规模编码基因的功能研究[Koike-Yusaetal.，2014；Shalemetal.，2014；Wangetal.，2014；Zhouetal.，2014]。最近，CRISPR系统的高通量优势也被成功地用到了基因元件的分析上[Korkmazetal.，2016；Rajagopaletal.，2016；Sanjanaetal.，2016]。这些研究表明，CRISPR/Cas9系统可用于高通量识别基因功能元件。构建高通量、通用的、无偏好sgRNA随机文库：不过现有的sgRNA文库针对特定的编码基因[Shalemetal.，2015]，或特定基因的调控区[Korkmazetal.，2016；Rajagopaletal.，2015；Sanjanaetal.，2016]，都只是针对基因组大约2％的编码区的限量的sgRNA文库或针对特殊的筛选。显而易见，远不能满足人的3x109bp的全基因组的需要。因此，构建高通量、通用的、无偏好sgRNA随机文库势在必行。因此，本专利技术拟构建sgRNA随机文库。参考文献BarrangouR，DoudnaJA.ApplicationsofCRISPRtechnologiesinresearchandbeyond.NatBiotechnol.2016，34(9)：933-941.CongL，RanFA，CoxD，LinS，BarrettoR，HabibN，HsuPD，WuX，JiangW，MarraffiniLA，ZhangF.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science2013，339(6121)：819-823.ConsortiumIHGS.Finishingtheeuchromaticsequenceofthehumangenome.Nature2004，431：931-45.ENCODEProjectConsortium.Identificationandanalysisoffunctionalelementsin1％ofthehumangenomebytheENCODEpilotproject.Nature2007，447：799-816.ENCODEProjectConsortium.AnintegratedencyclopediaofDNAelementsinthehumangenome.Nature2012，489：57-74.HsuPD，LanderES，ZhangF.DevelopmentandapplicationsofCRISPR-Cas9forgenomeengineering.Cell2014，157(6)：1262-1278.JinekM，ChylinskiK，FonfaraI，HauerM，DoudnaJA，CharpentierE.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science2012，337(6096)：816-821.KaelinWGJr.Molecularbiology.UseandabuseofRNAitostudymammaliangenefunction.Science2012，337(6093)：421-422.KleinstiverBP，PrewMS，TsaiSQ，TopkarVV，NguyenNT，ZhengZ，GonzalesAP，LiZ，PetersonRT，YehJR，AryeeMJ，JoungJK.EngineeredCRISPR-Cas9nucleases本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CRISPR/Cas9随机文库，其特征在于，包括sgRNA，所述的sgRNA含有识别序列，其中该序列的20个核苷酸第1个为G，2至20个为随机的核苷酸N。

【技术特征摘要】
2017.10.13 CN 20171095755101.一种CRISPR/Cas9随机文库，其特征在于，包括sgRNA，所述的sgRNA含有识别序列，其中该序列的20个核苷酸第1个为G，2至20个为随机的核苷酸N。2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9随机文库，其特征在于，所述的识别序列为随机识别序列。3.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9随机文库，其特征在于，所述的sgRNA包含骨架部分和随机识别序列组成。4.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9随机文库，其特征在于，所述的随机sgRNA还包含T7启动子序列。5.如权利要求1所述的CRIS...

【专利技术属性】
技术研发人员：周建奎，黄行许，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31