一种抑制胃癌细胞MGC-803的靶点及其应用制造技术

本发明专利技术属生物医药技术领域，提供一种抑制胃癌细胞MGC‑803的靶点，ARL8B基因和/或其参与的自噬途径。ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂包括：抗ARL8B的抗体、针对ARL8B编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、ARL8B介导的自噬途径抑制剂。RNA干扰分子为定向干扰MGC‑803细胞中ARL8B基因表达的siRNA分子。可以靶向干扰MGC‑803中ARL8B基因的表达，抑制胃癌细胞生长，促进细胞自噬水平。对开发新的抗胃癌药物具有重要指导作用，用于开发制备抗肿瘤药物，对胃癌的治疗有重大应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制胃癌细胞MGC-803的靶点及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种抑制胃癌细胞MGC-803的靶点及其应用，抑制ARL8B基因的表达，诱导抑制MGC-803的增殖。
技术介绍
ARL8B(全称ADP-ribosylationfactorlikeprotein8B；也被命名为ARL10C或Gie1)是与溶酶体结合来调控细胞自噬的小G蛋白，和另一个小G蛋白ARL8A(全称ADP-ribosylationfactorlikeprotein8A；也被命名为ARL10B或Gie2)的结构高度相似，正常生理条件下，在全身各器官内这两个蛋白都有表达，在已知的大多数肿瘤细胞内这两个蛋白质也都有表达。2011年《NatureCellBiology》杂志报道了Hela细胞内ARL8A和ARL8B的功能，当细胞处于营养充足的环境中，二者呈现一定的表达水平，促使溶酶体迁移到细胞外周，细胞处于低自噬状态。当Hela细胞处于营养缺乏的培养环境中，二者的表达量显著降低，此时溶酶体迁移到细胞中央发挥自噬功能，细胞处于高自噬水平。这篇文献证明了ARL8A和ARL8B是Hela细胞抵抗饥饿诱导自噬过程中调控溶酶体迁移的关键酶，二者的功能相同。2016年《Oncotarget》杂志报道在前列腺癌细胞内ARL8A几乎无表达，可认为是ARL8B单独表达型，降低ARL8B表达量会促进大鼠前列腺癌细胞凋亡，证明ARL8B是一个抗肿瘤药物靶点。从已知的ARL8A和ARL8B的表达量差异来看，肿瘤细胞应该可以分为ARL8B单独表达型、ARL8A单独表达型和二者共有型，也可能存在两种蛋白都没有表达的肿瘤细胞。迄今为止尚无ARL8A单独表达或二者都没有表达的肿瘤细胞被报道。为了寻找ARL8B单独表达的其它肿瘤细胞，我们利用了荧光定量PCR法测定了一些肿瘤细胞内ARL8A和ARL8B的相对表达量，发现了另一株ARL8B单独表达的肿瘤细胞株：胃癌细胞（MGC-803）。胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国发病率很高，其死亡率占恶性肿瘤的第一位，吸烟、饮食等不良生活习惯，以及幽门螺杆菌的持续感染等是造成胃癌高发的主要原因。胃癌的治疗主要有手术，放射治疗、化疗和中医药真情散治疗。人胃癌细胞MGC-803是从一位53岁男性原发性胃低分化粘液样腺癌患者建立的，该细胞贴壁生长，呈上皮细胞样，是研究胃癌的常用细胞株。RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性干扰特定基因的表达，所以该技术被广泛用于探索基因功能及肿瘤基因的治疗领域。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供了一种抑制胃癌细胞MGC-803的靶点，所述靶点为ARL8B基因和/或其参与的自噬途径。本专利技术的另一目的是提供了一种ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂在降低和/或消除胃癌细胞MGC-803药物中的应用。作为优选方案，所述ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂包括：抗ARL8B的抗体、针对ARL8B编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、ARL8B介导的自噬途径抑制剂。作为另一优选方案，所述的针对ARL8B编码序列的RNA干扰分子为定向干扰MGC-803细胞中ARL8B基因表达的siRNA分子。所述siRNA分子正义链序列为SEQIDNO.1，反义链序列为：SEQIDNO.2所示，为：正义链5'-CCACCUUCGUCAACGUGAUTT-3'，反义链5'-AUCACGUUGACGAAGGUGGTT-3'。所述siRNA分子定向干扰MGC-803细胞中ARL8B基因表达的方法包括以下步骤：（1）将MGC-803细胞接种到细胞培养板中，37℃，5%的CO2培养箱培养至细胞的混浊度达到60%-70%时备用；（2）用Opti-MEM稀释所述的siRNA分子和LipofectamineTM2000，室温下静置5分钟后，将两者混合，混匀并在室温下孵育20分钟；（3）将步骤（1）中培养细胞的DMEM完全培养基去掉，换成DMEM基本培养基，在37℃，5%的CO2培养箱孵育20min；（4）将步骤（2）所得的混合物加入步骤（3）的培养细胞中，在37℃，5%的CO2培养箱孵育5h后，去掉培养基，换成DMEM完全培养基继续培养24h-48h；（5）将步骤(4)所得细胞提蛋白，做WesternBlot检测。本专利技术利用荧光定量PCR法发现胃癌细胞内ARL8B基因单独表达，根据该靶点设计合成具有靶向专一性的siRNA作用于胃癌细胞MGC-803后特异性降解ARL8B的mRNA，干扰转录后的翻译过程，从而降低ARL8B蛋白的表达量，促进胃癌细胞MGC-803的自噬水平，诱导胃癌细胞凋亡，达到抑制肿瘤的作用。由此可见针对ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂可作为治疗胃癌细胞的药物应用，该抑制剂包括：抗ARL8B的抗体，针对ARL8B编码序列的RNA干扰分子如：siRNA定向干扰，shRNA定向干扰等，这些方法如果应用在降低ARL8B基因表达来促进肿瘤自噬作用，达到治疗肿瘤的目的。以此为药物作用机制实施抗肿瘤药物开发，均属于本专利技术的保护范围。ARL8B可以被认为是一种抑制胃癌细胞MGC-803的靶点，本专利技术提供的定向干扰MGC-803细胞中ARL8B基因表达的siRNA分子转染MGC-803细胞后，siRNA能特异性的与ARL8B基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后的翻译过程，诱导胃癌细胞凋亡，达到抑制肿瘤生长的作用。本专利技术所述的siRNA采用人工化学合成方法制备，对于开发新的抗肿瘤基因药物和肿瘤药物的治疗效果具有重要指导作用，可用于开发抗胃癌的临床用药，因此该ARL8B作为抑制胃癌细胞MGC-803的靶点极其降低其表达量的方法用于研发抗胃癌药物的用途是本项专利技术要求保护的利益。本项专利技术中我们利用定量PCR法发现胃癌细胞内ARL8B基因单独表达，而后设计合成靶向干扰胃癌细胞MGC-803中ARL8B基因的表达，促进细胞自噬水平，该结果对临床治疗胃癌提供良好的指导意义。附图说明图1为荧光定量PCR检测ARL8A和ARL8B基因在MGC-803细胞中的表达情况图，以β-actin为内参，横坐标表示不同基因，纵坐标表示ARL8A和ARL8B相对于GAPDH的表达量；图2为WesternBlotting检测siRNA转染MGC-803细胞后的ARL8A蛋白的表达量，包括对照组和干扰组；图3A为光镜下观察到的siRNA不同转染时间内胃癌细胞MGC-803对照组和干扰组的细胞状态图；图3B为光镜下观察到的siRNA不同转染时间内正常肝上皮纤维细胞HL7702的细胞状态图；图4为siRNA不同干扰时间对MGC-803和HL7702细胞的致死率；图5A为检测干扰前后的蛋白表达量的Westernblotting图；图5B为Westernblotting检测干扰前后的蛋白表达量统计柱状图，图5C为siRNA干扰前后LC3II/LC3I统计图。具体实施方式为使本专利技术更容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例只用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胃癌细胞MGC‑803的靶点，其特征在于：所述靶点为ARL8B基因和/或其参与的自噬途径。

【技术特征摘要】
1.一种胃癌细胞MGC-803的靶点，其特征在于：所述靶点为ARL8B基因和/或其参与的自噬途径。2.一种ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂在降低和/或消除胃癌细胞MGC-803药物中的应用。3.根据权利要求2所述的一种ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂在降低和/或消除胃癌细胞MGC-803药物中的应用，其特征在于：所述ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂包括：抗ARL8B的抗体、针对ARL8B编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、ARL8B介导的自噬途径抑制剂。4.根据权利要求3所述的一种ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂在降低和/或消除胃癌细胞MGC-803药物中的应用，其特征在于：所述的针对ARL8B编码序列的RNA干扰分子为定向干扰MGC-803细胞中ARL8B基因表达的siRNA分子。5.根据权利要求4所述的一种ARL8B基因和/或其参与的自噬途径的抑制剂在降低和/或消除胃癌细胞MGC-803药物中的应用，其特征在于：所述siRNA分子正义链序列为SEQIDNO.1，反义链序列为：SEQIDNO.2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢勇，赵京凤，赵晓宏，成钟，王楠，王洋，蔡大勇，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11