双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定链格孢霉毒素中的应用及方法技术

本发明专利技术涉及一种双[2,4,6‑三氯苯基]草酸酯在测定链格孢霉毒素中的应用及方法，本发明专利技术采用酶联免疫分析法，利用辣根过氧化物酶催化过氧化脲氧化3‑(4‑羟苯基)丙酸，生成能发荧光的3‑(4‑羟苯基)丙酸二聚体，进而在乙腈介质中，在增强剂咪唑的参与下，同双[2,4,6‑三氯苯基]草酸酯和过氧化脲反应产生强化学发光，建立了一种简单、快速、高灵敏度的测定细交链格孢菌毒素的化学发光间接竞争免疫分析方法；该方法的半抑制浓度IC50为95.2ng/L，在12.21～1562.50ng/L范围内成良好的线性关系，最低检出限LOD为2.53ng/L，能够用于链格孢霉毒素检测。

【技术实现步骤摘要】
双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定链格孢霉毒素中的应用及方法
本专利技术属于生物检测领域，涉及双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定链格孢霉毒素中的应用，还涉及双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯测定链格孢霉毒素的方法。
技术介绍
链格孢霉(Alternaria)是半知菌暗色丝孢菌中重要的一类真菌，能产生70余种真菌毒素和植物毒素，称为链格孢毒素，其中细交链孢菌酮酸(TA)是唯一被美国列入有毒化学物质登记册中的链格孢毒素，TA是链格孢霉中最为重要的毒素之一，可广泛污染蔬菜、水果及谷物。虽然能产生该毒素的链格孢菌株检出率低，但产毒能力很强，其毒素水平居各种链格孢毒素之首。TA能与其它真菌毒素协同作用，产生急性毒性。由于TA在大量商业产品中都被发现，例如谷物、果汁、西红柿产品、啤酒和胡萝卜，欧洲食品安全机构(EFSA)已经公布了这些毒素的最高限量标准，而我国目前由于对此类毒素研究较少，目前没有相关的限量法规。因此，发展一种高灵敏、快速和特异的方法来实现对TA的定量检测是十分必要的。目前针对TA的精测方法主要有气-液色谱法(GLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)等，此类方法测量结果准确度高、稳定性好，但通常需要大型的实验仪器和复杂的前处理过程，不适用于现场检测。酶联免疫分析法在检测TA中有很多优点，包括高选择性和特异性和使用不含放射性试剂。钟红等建立的TA残留检测间接竞争ELISA方法，最低检出限为0.02ng/mL，检测范围0.06-35.95ng/mL。马良等建立的基于鲁米诺体系的TA残留检测化学发光酶联免疫方法，最低检出限为0.01ng/mL，检测范围0.032-30.244ng/mL。此类方法不需要大型设备和严格的实验室条件，研制出的试剂盒使用方便快捷，可实现高通量的现场速测。过氧草酸酯类化学发光体系是一类高效的新型化学发光体系，这种体系除了具有发光效率高，强度大，寿命长的特点外，同时还可以通过成分选择和调节，使发光强度、持续时间和颜色满足特殊需要。在各种草酸酯类试剂中，双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯(TCPO)相比之下最为稳定，所以应用更为广泛一些。目前，以TCPO-H2O2-荧光物质化学发光体系为手段的检测方法有少量报道，主要集中在兽药残留、抗生素、葡萄球菌肠毒素C1、胆固醇、生物胺以及其他化学成分的检测，而在真菌毒素检测方面尚无相关研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定链格孢霉毒素中的应用；本专利技术的目的之二在于提供基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测链格孢霉毒素的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定链格孢霉毒素中的应用。优选的，所述测定使用化学发光酶联免疫分析法。优选的，所述化学发光是基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯─H2O2─3-(4-羟苯基)丙酸二聚体化学发光体系。2.基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测链格孢霉毒素的方法，包括如下步骤：在酶标板中包被链格孢霉毒素抗原，封闭后用抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体竞争，然后加入酶标二抗孵育，加入过氧化脲与3-(4-羟苯基)丙酸混合液酶催化反应后，转移至另一白色酶标板中，加入含咪唑的过氧化脲，混匀后加入双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液显色，酶标仪检测。优选的，所述包被为将浓度为0.25～1.0μg/mL的BSA修饰链格孢霉毒素加入酶标板中，4℃过夜。更优选的，所述BSA修饰链格孢霉毒素的浓度为0.5μg/mL。优选的，所述封闭为将脱脂奶粉溶液于37℃温育1h；甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次3min，所述脱脂奶粉溶液为每1.0g脱脂奶粉溶于20mLPBST的溶液。优选的，加入浓度为0.05～0.25μg/mL的抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体，温育；甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次至少3min。更优选的，所述抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体的浓度为0.2μg/mL，所述温育为37℃温育0.5h。本专利技术中，所述单抗由生物保藏编号为CCTCCNO：C201702的杂交瘤细胞制备，保藏于中国典型培养物保藏中心学，保藏日期为2016年12月27日。优选的，所述酶标二抗孵育为将HRP标记的羊抗鼠抗体稀释2000～8000倍，温育，甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板5次，每次至少3min。更优选的，所述HRP标记的羊抗鼠抗体稀释6000倍，温育为37℃温育1h。优选的，所述酶催化反应为将过氧化脲与3-(4-羟苯基)丙酸混合，控制pH值为6.0，温育5～30min；混合后所述过氧化脲浓度为4.0×10-3～12×10-3mol/L；所述3-(4-羟苯基)丙酸浓度为5×10-3～11×10-3mol/L。更优选的，过氧化脲浓度以8.0×10-3mol/L，3-(4-羟苯基)丙酸浓度为7.0×10-3mol/L。优选的，加入含咪唑的过氧化脲溶液，溶液中过氧化脲浓度为1～4mol/L，所述咪唑浓度为2×10-3mol/L，混匀后加入浓度为1～4×10-3mol/L的双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液。更优选的，溶液中过氧化脲浓度为1～2mol/L，双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液浓度为5×10-3mol/L。本专利技术的有益效果在于：本专利技术基于TCPO-H2O2-PHPPADimer体系的化学发光酶联免疫检测方法，将其首次应用于真菌毒素的检测；本专利技术通过酶联免疫分析法，辣根过氧化物酶催化过氧化脲氧化3-(4-羟苯基)丙酸(PHPPA)，生成能发荧光的3-(4-羟苯基)丙酸二聚体(PHPPADimer)。进而在乙腈介质中，在增强剂咪唑的参与下，同双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯和过氧化脲反应产生强化学发光；并且通过合理选择有机溶剂、避免水相体系的引入，解决过氧化草酸酯发光试剂难溶于水的问题，该方法的半抑制浓度IC50为95.2ng/L，细交链格孢菌酮酸在12.21～1562.50ng/L范围内成良好的线性关系，最低检出限LOD为2.53ng/L，对样品进行加标检测，面粉样品的平均回收率为76.24％-88.95％，燕麦样品的平均回收率为85.34％-93.28％。用该方法获得的结果与传统的酶联免疫分析法和鲁米诺化学发光分析方法进行了比较，得到了更为理想的结果。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为不同包被浓度对icCLEIA的影响。图2为单抗浓度对icCLEIA的影响。图3为酶标二抗稀释度对icCLEIA的影响。图4为缓冲液pH对icCLEIA的影响。图5为酶反应中过氧化脲浓度对icCLEIA的影响。图6为PHPPA浓度对icCLEIA的影响。图7为酶反应时间对icCLEIA的影响。图8为TCPO浓度对icCLEIA的影响。图9为显色中过氧化脲浓度度对icCLEIA的影响。图10为增强剂咪唑浓度对icCLEIA的影响。图11icCLEIA标准工作曲线(n＝3)。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。本专利技术实施例使用的仪器和试剂如下：恒温培养箱(长本文档来自技高网...

【技术保护点】
双[2,4,6‑三氯苯基]草酸酯在测定链格孢霉毒素中的应用。

【技术特征摘要】
1.双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯在测定链格孢霉毒素中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述测定使用化学发光酶联免疫分析法。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述化学发光是基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯─H2O2─3-(4-羟苯基)丙酸二聚体化学发光体系。4.基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测链格孢霉毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：在酶标板中包被链格孢霉毒素抗原，封闭后用抗细交链格孢菌酮酸单克隆抗体竞争，然后加入酶标二抗孵育，加入过氧化脲与3-(4-羟苯基)丙酸混合液酶催化反应后，转移至另一白色酶标板中，加入含咪唑的过氧化脲，混匀后加入双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯乙腈溶液显色，酶标仪检测。5.根据权利要求4所述基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测链格孢霉毒素的方法，其特征在于：所述包被为将浓度为0.25～1.0μg/mL的BSA修饰链格孢霉毒素加入酶标板中，4℃过夜。6.根据权利要求4所述基于双[2,4,6-三氯苯基]草酸酯检测链格孢霉毒素的方法，其特征在于：所述封闭为将脱脂奶粉溶液于37℃温育1h；甩板后在滤纸上拍干，PBST洗板2次，每次3min，所述脱脂奶粉溶液为每1.0g脱脂奶粉溶于20mLPBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：马良，潘姝历，张宇昊，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50