细胞培养基及使用其的培养方法技术

本发明专利技术的课题在于提供一种不使用饲养细胞而能够提高细胞的增殖效率的细胞培养基，特别是提供一种不含有血清的细胞培养基。根据本发明专利技术，可以提供一种含有纤维蛋白5及Zeta多肽的细胞培养基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞培养基及使用其的培养方法
本专利技术涉及使用了纤维蛋白5及Zeta多肽的细胞培养基、细胞用培养基试剂盒、细胞培养系统、细胞的培养方法、以及iPS细胞增殖剂。
技术介绍
通过近年来的研究，人ES细胞(hESC)或人iPS细胞(hiPSC)等人多能干细胞在再生医疗领域中实用化的可能性正在增高。这些多能干细胞具有能够无限增殖的能力和分化成神经细胞、心肌细胞、血液细胞或网膜细胞等各种细胞的能力，作为对疑难疾病、生活习惯病等的治疗方法而备受期待。饲养细胞起到将用于维持培养多能干细胞、特别是人多能干细胞的生长因子供给于干细胞的作用。因此，一直以来，hESC、hiPSC等人多能干细胞的培养主要在源自小鼠的饲养细胞(MEF：小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast))层上进行。然而，在源自小鼠的饲养细胞共存下进行培养的方法会在人多能干细胞中混入饲养细胞，因此在对生物体的安全性上存在问题。因此，作为不使MEF等饲养细胞混入人多能干细胞而进行培养的方法，已知有将MEF化学固定于培养基材而培养多能干细胞的方法(非专利文献1)。但是，上述培养方法仍存在未固定的细胞、剥离的细胞混入的可能性，并非完全防止饲养细胞的混入。而且，存在饲养细胞的品质不稳定的问题。另一方面，作为能够维持培养人多能干细胞的活性，报告了各种人细胞类型(非专利文献2～5)。另外，还报告了不使用异种细胞而使用成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞、子宫内膜细胞等各种源自人的细胞作为饲养细胞的方法(非专利文献6)。但是，在源自人的饲养细胞的共存下进行多能干细胞培养的方法存在培养时制备该饲养细胞费事的问题、饲养细胞的品质不稳定的问题。作为在饲养细胞不共存下培养多能干细胞的技术，已知有使用预先将培养基用MEF条件化培养基(MEF-CM)进行培养的方法。例如，专利文献1中记载了制备细胞条件化培养基(conditionedmedium)的方法、及在MSC条件化培养基中存在14-3-3蛋白质zeta/delta(14-3-3proteinzeta/delta)的情况，所述制备细胞条件化培养基的方法包括：在细胞培养用培养基中对间充质干细胞(MSC)、其后代或源自其的细胞系(cellline)进行培养的工序；以及对上述细胞培养基任选进行分离的工序，在所述细胞培养基中，以不一起培养的方式将胚胎干(ES)细胞集落或其后代接种于含有FGF的无血清培养基中，并使得到的细胞增殖，从而获得上述间充质干细胞(MSC)。然而，在使用了这些条件化培养基的培养方法中，存在必须制备条件化培养基的繁琐、饲养细胞的品质不稳定的问题，而且仅举出了14-3-3蛋白质zeta/delta作为MSC条件化培养基中所含有的蛋白质的一个例子。另一方面，不需要利用各种细胞进行条件化的培养基、即化学成分确定的培养基的开发也在进行。例如，报告了通过添加玻璃体结合蛋白与IGF1的嵌合蛋白质(chimericprotein)而能够不使用饲养细胞培养ES细胞(非专利文献7)。另外，作为含有具有促进增殖效果的IGF的培养基，已有STEMCELLTechnologies公司的mTeSR1(注册商标)、LifeTechnologies公司的STEMPRO(注册商标)等在市场销售。但是，对于多能干细胞的培养而言，仍存在无法稳定地培养、增殖性差这样的课题。另外，虽然对MEF的分泌物中的功能性蛋白质进行了分析(非专利文献8)，但尚未从条件化培养基中所含有的饲养细胞的分泌物中鉴定出有益的功能性蛋白质。另外，为了对多能干细胞进行培养，通常使用含有牛血清、KNOCKOUTTMSR(KnockoutSerumReplacement：可以通过用于替代血清而对ES/iPS细胞进行培养的添加剂)等的培养基。但是，这些多数含有源自牛血清的蛋白质，因此可能有牛海绵状脑病(BSE)等传染病的危险性，而且牛血清可能含有病毒，因此存在病毒导致的细胞污染的隐患。另一方面，虽然有时使用源自人的血清，但是存在传染病的危险性、难以稳定地获得的问题，而且也存在伦理上的问题，是不实用的。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2010-500047号公报非专利文献非专利文献1：YueX-S,FujishiroM,NishiokaC,AraiT,TakahashiE,GongJ-S,AkaikeT,ItoY.Feedercellssupportthecultureofinducedpluripotentstemcellsevenafterchemicalfixation.PLoSONE2012；7:e32707.非专利文献2：HovattaO,MikkolaM,GertowKetal.Aculturesystemusinghumanforeskinfibroblastsasfeedercellsallowsproductionofhumanembryonicstemcells.HumReprod2003；18:1404-1409.非专利文献3：RichardsM,FongCY,ChanWKetal.Humanfeederssupportprolongedundifferentiatedgrowthofhumaninnercellmassesandembryonicstemcells.NatBiotechnol2002；20:933-936.非专利文献4：ChengL,HammondH,YeZetal.Humanadultmarrowcellssupportprolongedexpansionofhumanembryonicstemcellsinculture.StemCells2003；21:131-142.非专利文献5：RichardsM,TanS,FongCYetal.Comparativeevaluationofvarioushumanfeedersforprolongedundifferentiatedgrowthofhumanembryonicstemcells.StemCells2003；21:546-556.非专利文献6：福角勇人、金村米博人ES/iPS细胞的无饲养细胞培养技术的开发医学的进步(医学のあゆみ)2011；239:1338-1344.非专利文献7：MantonKJ,RichardsS,VanLonkhuyzenD,CormackL,LeavesleyD,UptonZ,Achimericvitronectin：IGF-Iproteinsupportsfeeder-cell-freeandserum-freecultureofhumanembryonicstemcells,StemCellsDev.2010,19(9):1297-1305非专利文献8：ChinAC,FongWJ,GohLT,PhilpR,OhSK,ChooAB.Identificationofproteinsfromfeederconditionedmediumthatsupporthumanembryonicstemcells.JournalofBiotechnology,2007；130:320-8.
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术所要解决的课题本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养基，其含有纤维蛋白5及Zeta多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.29 JP 2014-1979221.一种细胞培养基，其含有纤维蛋白5及Zeta多肽。2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，在基础培养基中含有分离后的纤维蛋白5及分离后的Zeta多肽。3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，以1︰50～50︰1的质量比含有纤维蛋白5及Zeta多肽。4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养基，其中，培养基中含有的纤维蛋白5的浓度为2ng/ml以上且100ng/ml以下，和/或培养基中含有的Zeta多肽的浓度为2ng/ml以上且100ng/ml以下。5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞培养基，其不含有选自白蛋白、血清及条件化培养基中的1～3种。6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞培养基，其中，基础培养基为Essential8(注册商标)培养基。7.一种细胞用培养基试剂盒，其含有纤维蛋白5、Zet...

【专利技术属性】
技术研发人员：加藤智久，金村米博，正札智子，福角勇人，
申请(专利权)人：株式会社钟化，独立行政法人国立病院机构，
类型：发明
国别省市：日本,JP