一种辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法及其应用。用于快速鉴定和筛选我国辣椒资源中具有黄瓜花叶病毒病抗性的种质资源。取纯化后的黄瓜花叶病毒毒源在枯斑三生烟上人工注射接种，接种后12～15天采收病叶，病叶加入磷酸缓冲液冰浴匀浆，双层纱布过滤或离心，其滤液或上清液即为接种液。辣椒子叶期到5‑6叶期均可接种。其中1‑2叶期为最佳接种苗龄，用一次性注射器(1mL)吸取1mL接种液，用针头在子叶上扎出2个针孔，去掉针头，在子叶背面针孔处将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液。接种14天后进行病情调查。本方法的优点在于，易于控制病毒接种量，接种时直接注入叶肉细胞，易于观察，减少漏接。

Inoculation method of pepper cucumber mosaic virus at seedling stage and its application

The invention relates to an inoculation method for pepper cucumber mosaic virus at seedling stage and its application. It is used for rapid identification and screening of germplasm resources with cucumber mosaic virus resistance in pepper resources in China. The purified cucumber mosaic virus poison source is inoculated artificially on the dry spot three tobacco. After 12~15 days of inoculation, the disease leaves are collected, the sick leaves are added to the ice bath homogenate with phosphate buffer solution, the double layer gauze is filtered or centrifuged, and the filtrate or the supernatant is the inoculation solution. The chili subleaf period can be inoculated at the 5 stage and 6 leaf stage. 1 of the 2 leaf stages were the best inoculation age, using the disposable syringe (1mL) to absorb the 1mL inoculation liquid, with the needle in the cotyledon with 2 pinholes, remove the needle and slow injection of the inoculation liquid at the pinhole on the back of the cotyledon, so that the two leaf leaves were filled with the virus inoculation solution. The disease was investigated after 14 days of inoculation. The advantages of the method are that it is easy to control the inoculation quantity of virus and directly infuse mesophyll cells when inoculated, so that it is easy to observe and reduce leakage.

【技术实现步骤摘要】
一种辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法及其应用
本专利技术属于植物保护领域，涉及一种辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法及其应用。
技术介绍
温带为黄瓜花叶病毒病(CMV)的主要分布地区，热带地区呈现逐年加重的趋势。目前为止，CMV的寄主范围超过100个科1200种植物，对多种蔬菜作物和观赏植物的危害尤为严重。CMV主要是通过多种蚜虫以非持续方式传播，部分植物可种子传毒。广泛的寄主范围，蚜虫传毒和作物品种更替频率小等原因使得CMV可周年存活，导致其难以防治。我国辣椒主产区CMV检测率很高，北京、陕西、湖广以及江浙地区的检出率均在50％以上。CMV侵染辣椒后表现为渐进的发病过程。发病早期幼嫩的叶片基部黄化，然后黄化症状逐渐扩展到整个叶片；随后新生叶片表现出明显的花叶；随着植株发育，叶片出现严重皱缩，植株矮化，叶色表现为无光泽的深绿色。辣椒感染CMV症状的严重程度取决于感染时的株龄，一般幼苗期感染CMV会造成秃顶、矮化并减产，严重时可造成绝收；而成株感染CMV后的症状相对较轻。抗病性鉴定是抗病材料筛选、抗性遗传规律研究和抗病品种选育的基础，其关键在于能够准确反映材料的抗性水平。辣椒抗CMV鉴定大多采用人工接种鉴定的方法。目前CMV人工接种方法包括手指摩擦接种、磨砂玻匙接种、喷枪接种和病毒汁液浸沾接种。前3种方法在接种前需在叶表喷撒一薄层600目(直径大约为23μm)的金刚砂，接种30min后将多余的接种物清洗掉。手指摩擦接种和磨砂玻匙接种容易操作，但是接种不均匀。喷枪接种所用的喷枪为油漆喷枪，接种时喷枪距幼苗2cm左右，空气压缩机的工作压力为2.1～2.5kg·cm，喷枪接种适用于大量材料的抗性鉴定，存在接种不均匀和漏接的问题。在我国该种方法在辣椒抗CMV材料筛选中有部分应用。病毒汁液浸根法是指将幼苗根部的泥土洗净，浸入接种液中，该方法的接种效果最好，但是工作量大，不易操作，使用不多。针对以上接种方法中存在的问题，建立一种新的、更为有效的辣椒抗CMV接种方法势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对目前我国辣椒抗CMV苗期鉴定方法中存在的问题，提供一种新的、更为有效和完善的苗期接种方法及其应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法，包括如下步骤：(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟(NicotianatabaccumCVSSamunNN)上人工注射接种，接种后12～15天采收病叶；将病叶加入磷酸缓冲液冰浴匀浆，过滤或离心，其滤液或上清液即为接种液；(2)辣椒种子消毒后人工培养至幼苗2片真叶完全展开时即可接种；(3)用1mL无菌注射器吸取1mL菌液，用针头在子叶上扎出2个针孔，去掉针头，在子叶背面针孔处将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液，接种后，昼夜温度保持在25℃，幼苗正常生长管理。其中，所述的磷酸缓冲液优选为pH值为7的0.02Mol·L-1的磷酸缓冲液；每克病叶加入5mL所述的磷酸缓冲液进行冰浴匀浆。所述的过滤方法优选双层纱布过滤；所述的离心的条件为3500转·分-1离心15分钟。辣椒种子在5％的次氯酸钠中消毒20分钟后，用无菌水冲洗3-4次。人工培养辣椒种子的方法优选为：辣椒种子消毒后在培养皿中于25℃黑暗条件下萌发，种子萌发后播种于8×8的营养钵中生长，生长期温度为昼25摄氏度/夜20℃，幼苗2片真叶完全展开时即可接种。本专利技术所述的方法在快速鉴定和筛选辣椒资源中具有黄瓜花叶病毒病抗性的种质资源中的应用。所述的应用优选按照所述的辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法接种辣椒幼苗，接种14天后对辣椒幼苗进行病情调查。所述的应用进一步优选，优选依据我国“八五”辣椒抗病育种攻关组制定的分级标准对病情进行分级，0级-无任何症状；1级-心叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级-系统花叶或茎上产生坏死斑点；5级-系统重花叶、畸形或茎上产生坏死条斑；7级-多数叶片畸形、蕨叶、植株矮化或茎、枝和叶脉系统坏死；9级-植株严重矮化，停止生长或严重系统坏死，至全株死亡；病情指数＝∑(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100。材料或群体抗病性划分标准为：免疫(I)：DI＝0；高抗(HR)：0﹤DI≦5；抗病(R)：5﹤DI≦20；中抗(MR)：20﹤DI≦40；感病(S)：DI﹥40。一种辣椒抗CMV苗期接种鉴定方法，包括以下步骤：(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟(NicotianatabaccumCVSSamunNN)上人工注射接种，接种后12～15天采收病叶，每1g病叶加入5mlPh值为7的0.02Mol·L-1的磷酸缓冲液冰浴匀浆，双层纱布过滤或3500转·分-1离心15分钟，其滤液或上清液即为接种液；(2)辣椒种子在5％的次氯酸钠中消毒20分钟后，用无菌水冲洗3-4次；(3)辣椒种子消毒后在培养皿中于25℃黑暗条件下萌发，种子萌发后播种于8×8的营养钵中生长，生长期温度为昼25℃/夜20℃，幼苗2片真叶完全展开时即可接种；(4)用一次性注射器吸取1mL菌液，用针头在子叶上扎出2个针孔，去掉针头，在子叶背面针孔处将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液。接种后，昼夜温度保持在25℃，幼苗正常生长管理；(5)接种14天后对辣椒幼苗进行病情调查，依据我国“八五”辣椒抗病育种攻关组制定的分级标准进行分级，计算病情指数；分级标准为：0级-无任何症状；1级-心叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级-系统花叶或茎上产生坏死斑点；5级-系统重花叶、畸形或茎上产生坏死条斑；7级-多数叶片畸形、蕨叶、植株矮化或茎、枝和叶脉系统坏死；9级-植株严重矮化，停止生长或严重系统坏死，至全株死亡。所述的病情指数计算方法优选为：病情指数＝∑(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100。材料或群体抗病性划分标准为：免疫(I)：DI＝0；高抗(HR)：0﹤DI≦5；抗病(R)：5﹤DI≦20；中抗(MR)：20﹤DI≦40；感病(S)：DI﹥40。有益效果本专利技术的优点在于：相对于目前常用接种方法，该方法不需要喷洒金钢砂，减少了操作步骤，直接针头注射，易于控制病毒接种量且对叶片损伤较小，接种液可直接注射到叶肉细胞，易于观察，减少漏接。本专利技术对研究室现有的部分辣椒种质资源进行鉴定取得了满意结果。表明该方法可以用于快速筛选我国辣椒资源中具有抗CMV的辣椒种质资源进行鉴定，拓宽辣椒抗CMV的资源利用。具体实施方式实施例1(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟(NicotianatabaccumCVSSamunNN)上繁殖，人工注射接种，接种后12～15天采收病叶。每1g病叶加入5mlPh值为7的0.02Mol·L-1的磷酸缓冲液冰浴匀浆，双层纱布过滤或3500转·分-1离心15分钟，其滤液或上清液即为接种液；(2)辣椒种子在5％的次氯酸钠中消毒20分钟后，用无菌水冲洗3-4次；(3)辣椒种子消毒后在培养皿中于25℃黑暗条件下萌发，种子萌发后播种于8×8的营养钵中生长，生长期温度为昼25摄氏度/夜20℃，幼苗2片真叶完全展开时即可接种。(4)用一次性注射器(1mL)吸取1mL菌液，去掉针头，将菌液在辣椒子叶的背面缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液。接种后，昼夜温度保持在25℃，幼苗正常生本文档来自技高网...

【技术保护点】
辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟(Nicotiana tabaccum CVS Samun NN)上人工注射接种，接种后12～15天采收病叶；将病叶加入磷酸缓冲液冰浴匀浆，过滤或离心，其滤液或上清液即为接种液；(2)辣椒种子消毒后人工培养至幼苗2片真叶完全展开时即可接种；(3)用1mL无菌注射器吸取1mL菌液，用针头在子叶上扎出2个针孔，去掉针头，在子叶背面针孔处将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液，接种后，昼夜温度保持在25℃，幼苗正常生长管理。

【技术特征摘要】
1.辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟(NicotianatabaccumCVSSamunNN)上人工注射接种，接种后12～15天采收病叶；将病叶加入磷酸缓冲液冰浴匀浆，过滤或离心，其滤液或上清液即为接种液；(2)辣椒种子消毒后人工培养至幼苗2片真叶完全展开时即可接种；(3)用1mL无菌注射器吸取1mL菌液，用针头在子叶上扎出2个针孔，去掉针头，在子叶背面针孔处将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液，接种后，昼夜温度保持在25℃，幼苗正常生长管理。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的磷酸缓冲液为pH值为7的0.02Mol·L-1的磷酸缓冲液；每克病叶加入5mL所述的磷酸缓冲液进行冰浴匀浆。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的过滤方法为双层纱布过滤；所述的离心的条件为3500转·分-1离心15分钟。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于辣椒种子在5％的次氯酸钠中消毒20分钟后，用无菌水冲洗3-4次。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于人工培养辣椒种子的方法为：辣椒种子消毒后在培养皿中于25℃黑暗条件下萌发，种子萌发后播种于8×8的营养钵中生长，生长期温度为昼25摄氏度/夜20℃，幼苗2片真叶完全展开时即可接种。6.权利要求1所述的方法在快速鉴定和筛选辣椒资源中具有黄瓜花叶病毒病抗性的种质资源中的应用。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于按照权利要求1-5中任一项所述的辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法接种辣椒幼苗，接种14天后对辣椒幼苗进行病情调查。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于依据我国“八五”辣椒抗病育种攻关组制定的分级标准对病情进行分级，0级-无任何症状；1级-心叶明脉或接种叶急性小枯斑；3级-系统花叶或茎上产生坏死斑点；5级-系统重花叶、畸形或茎上产生坏死条斑；7级-多数叶片畸形、蕨叶、植株矮化或茎、枝和叶脉系统坏死；9级-植株严重矮化，停止生长或严重系...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭广君，王述彬，刘金兵，潘宝贵，刁卫平，戈伟，高长洲，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32