一种利用多粘类芽孢杆菌制备DDP-IV抑制剂的方法及制备出的DDP-IV抑制剂技术

本发明专利技术公开的一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP‑IV抑制剂的方法，该方法包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵；(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP‑IV抑制剂。本发明专利技术技术方案的优点在于，极大简化了生产步骤，仅需发酵、加热灭活、离心和冷冻干燥四步，大大减少了传统复杂工艺可能带来的污染问题。制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用多粘类芽孢杆菌这单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。

Method for preparing DDP-IV inhibitor by using Bacillus cereus and preparation of DDP-IV inhibitor

The invention discloses a method for preparing DPP IV inhibitor by using Bacillus spore bacillus. The method comprises the following steps: (1) inoculating Bacillus sticky bacillus in skimmed milk for fermentation; (2) after heating the fermentation product in step (1), the supernatant is collected by centrifugation, and the collected supernatant is dried after freezing and drying. DPP IV inhibitors. The advantages of the technical scheme of the invention are that the production step is greatly simplified, only four steps are needed for fermentation, heating and inactivation, centrifugation and freeze drying, which greatly reduces the pollution problems that may be brought by the traditional complex process. The fermentation medium used in the preparation is wide, low cost, natural safety, avoiding the use of chemical synthetic medium, and the single strain of Bacillus sticky bacillus, and the combination of the above raw materials and strains, is beneficial to the standardization of product quality and the cost control of large-scale industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种利用多粘类芽孢杆菌制备DDP-IV抑制剂的方法及制备出的DDP-IV抑制剂
本专利技术属于生物
，具体为一种利用多粘类芽孢杆菌制备DDP-IV抑制剂的方法及制备出的DDP-IV抑制剂。
技术介绍
近年来，糖尿病(DiabetesMellitus，DM)在全世界广泛流行，目前已成为继肿瘤、心血管疾病之后第三大类严重危害人类健康的慢性疾病。随着我国经济、社会的迅速发展，膳食结构和生活方式的改变，人口老龄化速度的加快，糖尿病的患病率也呈现快速增加的趋势。据统计，2015年全球糖尿病患者约有4.15亿人，而我国糖尿病患者约1.1亿人，已位居世界首位，而且5年间的增长率近20％。在糖尿病患病率快速上升的同时，我国糖尿病的知晓率、治疗率及控制率明显偏低。糖尿病已成为一个严重危害我国人群健康的公共卫生问题，对经济社会发展产生越来越严重的影响。1999年WHO将糖尿病分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病占所有糖尿病患病率的90％以上。Ⅰ型糖尿病的治疗主要是通过注射胰岛素或其类似物，而Ⅱ型糖尿病患者不需要依靠胰岛素，可使用口服降糖药、胰岛素及其类似物。对于大多数患者而言，口服降糖药是经济、实用、便利的治疗方案。目前治疗Ⅱ型糖尿病的口服降糖药物主要有：双胍类、磺脲类及非磺脲类胰岛素促泌剂、噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂、α-葡糖糖苷酶抑制剂、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂、二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制剂以及钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂等。DPP-Ⅳ是位于细胞表面的一种丝氨酸蛋白酶，广泛存在于肾脏、胃肠道、结缔组织和淋巴结等组织中。GLP-1是由肠道内L细胞分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖素，在体内具有抑制血糖升高作用，但易被DPP-IV降解而失去活性。DPP-IV抑制剂能有效延长GLP-1半衰期，增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，调节血糖浓度。DPP-IV抑制剂与其他口服降糖药物的不同是，仅在人体血糖高于正常水平的情况下才会增加人体胰岛素的分泌。在低血糖的时候，肠促胰岛激素与β细胞表面的特异性受体结合后，仅引发钙离子的少量内流和胰岛素的微量释放，不会导致血糖的进一步降低，所以这类药物的应用不会引起低血糖。由于诸多优势，DPP-IV抑制剂已是降糖药市场的新霸主。2006年全球首个上市的DPP-IV抑制剂—西格列汀(商品名：捷诺维)，在2016年联同其复方制剂—西格列汀+二甲双胍(商品名：捷诺达),二者销售合计达到61亿美元，超过了甘精胰岛素(Lantus)的销售额，成为全球最畅销的降糖药。目前，临床上所使用的各种DPP-IV抑制剂，都属于化学药，主要通过化学合成的方法制得，其合成工艺复杂，环境污染压力较大，所以，开拓DPP-IV抑制剂全新的来源方式，将是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
为解决现有技术中DPP-IV抑制剂只能通过化学合成制备得到的缺陷，本专利技术提供了一种利用多粘类芽孢杆菌制备DDP-IV抑制剂的方法及制备出的DDP-IV抑制剂，实现的目的为采用生物发酵方法制备出新型DPP-IV抑制剂，得到的抑制剂具有强烈和稳定的抑制活性。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的拉丁文分类命名为paenibacilluspolymyxa，保藏编号为CGMCCNo.10062，保藏时间为2014年11月26日，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x106～2x107cfu/mL；该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。邮编：100101。(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP-IV抑制剂。本专利技术公开的制备方法，首次采用多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)CGMCCNo.10062，以脱脂乳为培养基进行发酵，水浴加热灭活菌体和多种蛋白酶，离心取上清，冷冻干燥制备得到二肽基肽酶-IV抑制剂，披露了多粘类芽孢杆菌CGMCCNo.10062具有发酵脱脂乳生成二肽基肽酶-IV抑制剂的新用途，拓宽了二肽基肽酶-IV抑制剂的来源。同时，上述制备方法与超滤等方法相比，操作更加简单，成本更低，适用于工业化生产，并且多粘类芽孢杆菌CGMCCNo.10062发酵脱脂乳所制备的二肽基肽酶-IV抑制剂的活性强，稳定性好。进一步的，所述步骤(1)中的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％～10％。进一步的，所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm～220rpm。进一步的，所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm～220rpm。进一步的，所述步骤(2)中水浴加热温度为75℃～100℃，加热时间为10min～30min。进一步的，所述步骤(2)中离心加速度为8,000g～12,000g，离心时间为10min～40min。进一步的，所述步骤(2)中冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的燥温度为-25℃～-35℃，真空冷冻干燥的时间为16h～32h，真空冷冻干燥的真空度为10Pa～30Pa。本专利技术自然要求保护经过上述制备方法得到的DPP-IV抑制剂，该抑制剂对DPP-IV的半抑制浓度IC50≤20mg/mL。本专利技术采用上述技术方案，包括以下有益效果：本专利技术利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂，极大简化了生产步骤，仅需发酵、加热灭活、离心和冷冻干燥四步，大大减少了传统复杂工艺可能带来的污染问题。制备所采用的发酵培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用多粘类芽孢杆菌这单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术做进一步的详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、试剂、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。实施例一：本专利技术提供的一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x106cfu/mL；(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP-IV抑制剂。所述步骤(1)中的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％。所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm。所述步骤(1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP‑IV抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x10

【技术特征摘要】
1.一种利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行发酵，所述多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.10062，所述多粘类芽孢杆菌的接种量为：多粘类芽孢杆菌在发酵产物的终浓度为2x106～2x107cfu/mL；(2)将步骤(1)得到的发酵产物水浴加热后，离心收集上清液，将收集到的上清液冷冻干燥后得到DPP-IV抑制剂。2.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的脱脂乳包括脱脂乳粉和水，脱脂乳粉占脱脂乳的质量百分比为5％～10％。3.根据权利要求1所述的利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵方法为将多粘类芽孢杆菌接种于脱脂乳中进行振荡培养，振荡速度为125rpm～220rpm。4.根据权利要求1或3所述的利用多粘类芽孢杆菌制备DPP-IV抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴正钧，冯华峰，韩瑨，游春苹，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31