一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法技术

本发明专利技术涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育fhl 1b基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的fhl 1b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA和Cas9‑mRNA，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养60h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明专利技术脱靶率很低，且干扰掉fhl 1b基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示心脏形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上心脏疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

A gene knockout method for breeding fhl1b gene deficient zebrafish

The invention relates to the field of gene knockout technology, in particular a method of gene knockout and breeding of FHL 1B gene deletions zebrafish. By CRISPR/Cas9 gene editing technique, a suitable targeting site is designed on the FHL 1B gene of zebrafish, and the specific sgRNA and Cas9 mRNA, synthesized in vitro, are microinjected into the spot. After the embryo was cultured in 60H, the genotype was analyzed by embryo selection, which confirmed the validity of the selected loci. The present invention has a low miss rate and interferes with the FHL 1B gene, and studies its function by means of genetic means, which helps to further reveal the whole process of heart morphogenesis and the molecular mechanism of regulating these processes. It is of great significance in the understanding of the pathology of the medical heart disease and the development of a new treatment scheme. .

【技术实现步骤摘要】
一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法
本专利技术涉及基因敲除领域，特别是公开了一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法。
技术介绍
fhl1b(fourandahalfLIMdomains1b)基因位于斑马鱼第10号染色体上，包含6个外显子和5个内含子，cDNA全长1512bp，编码280氨基酸，fhl1b包含有4个进化上保守的功能结构域，研究发现，利用Morpholino干扰技术，干扰掉fhl1b基因斑马鱼胚胎，出现明显的发育畸形，同时通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现fhl1b在人类胚胎早期的多个组织中都有表达，特别是心脏中强烈表达。斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且fhl1b基因进化上较为保守，研究发现fhl1b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的fhl1b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA(终浓度20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度150ng/μL)，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养60h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法，找到了合适的打靶位点，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出fhl1b基因缺失型斑马鱼。解决上述技术问题的技术方案如下：1)设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)上查询斑马鱼fhl1b基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站TheZiFiTTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计fhl1b基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响fhl1b基因的整个结构域，从而来改变基因的表达。两对特异性靶位点PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgtcaccataaggggaaatacGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgaggacgctcctcgctgccaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACTPCR检测引物PCR检测引物上下游引物分别位于2号和3号内含子上：F(5’-CGGTCTTTAGTGACATTCTGCT-3’)R(5’-TGTGGGCCTAGTCTTAGCTTA-32)构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测。b，特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：混匀后于37℃水浴，酶切2h以上。c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA。正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子20pb靶序列20bpgRNA上游骨架；反向引物R：20bpgRNA下游骨架PCR反应体系(25μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃3min，(变性95℃15s，退火60℃15s，延伸72℃15s)32个循环，再72℃5min。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果。d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物。e，测定纯化的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下。体外转录反应体系(20μL)：将反应物都加入0.2mLRNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h；水浴结束后，向转录体系中加入1μLDNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1μL样品，用配制好的1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；f)，特异性gRNA的纯化用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃。吸取纯化后的gRNA溶液1μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度。3)斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中。在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为150ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL。注射约1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/LNaCl，0.33mmol/LCaCl2，0.33mmol/LMgSO4，0.17mmol/LKCl，)中，28℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析。显微注射体系如下：4)Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其fhl1b基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范。a、提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精60小时后(60hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mLEp管中(每管10颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼fhl1b基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl‑heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计fhl1b基因的靶位点；两对特异性靶位点PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgtcaccataaggggaaatacGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgaggacgctcctcgctgccaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACTPCR检测引物PCR检测引物上下游引物分别位于2号和3号内含子上：F(5’‑CGGTCTTTAGTGACATTCTGCT‑3’)R(5’‑TGTGGGCCTAGTCTTAGCTTA‑3；2)构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上；b，特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒；酶切反应总体积为20μL，体系如下：...

【技术特征摘要】
1.一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)上查询斑马鱼fhl1b基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站TheZiFiTTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计fhl1b基因的靶位点；两对特异性靶位点PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgtcaccataaggggaaatacGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgaggacgctcctcgctgccaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACTPCR检测引物PCR检测引物上下游引物分别位于2号和3号内含子上：F(5’-CGGTCTTTAGTGACATTCTGCT-3’)R(5’-TGTGGGCCTAGTCTTAGCTTA-3；2)构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上；b，特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒；酶切反应总体积为20μL，体系如下：混匀后于37℃水浴，酶切2h以上；c,以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子20pb靶序列20bpgRNA上游骨架，反向引物R：20bpgRNA下游骨架，PCR反应体系如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；e，测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA；具体操作如下：体外转录反应体系：将反应物全部加入0.2mLEP管中，混匀之后，于37℃水浴2h；水浴结束后，消化DNA模板，然后电泳；f，特异性gRNA的纯化用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃；进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；3)斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为150ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射约1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于E3水中，28℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；显微注射体系如下：4)Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其fhl1b基因是否存在突变；a,提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精60小时后(60hpf)，分别收集野生型和注射后胚胎于1.5mLEp管中，每管10颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：向装有胚胎的Ep管中加入200μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解过夜；裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；加入75％乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干20m...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓云，罗孝宇，吴秀山，王跃群，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43