本发明专利技术涉及农业生物技术领域，具体涉及内切葡聚糖酶NfEG12A突变体及其编码基因和应用。所述突变体为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切葡聚糖酶NfEG12A的第7位和/或第111位的氨基酸Y突变为W。本发明专利技术的突变体的最适温度与最适pH均与野生酶一致，为65℃和pH 5.0，这些突变体对β‑1,3‑1,4‑葡聚糖和木葡聚糖的催化效率分别提高了0.5‑0.8倍，且具有良好的耐热性和pH耐受性，因此在工业中有非常可观的应用前景。
Endonuclease NfEG12A mutant and its coding gene and Application
The invention relates to the field of agricultural biotechnology, in particular to an endonuclease NfEG12A mutant and its coding gene and application. The mutant is a seventh and 111st amino acid Y of the endo dextran NfEG12A expressed in amino acid sequences, such as SEQ ID No.1, W. The optimum temperature and optimum pH of the mutant were in accordance with the wild enzyme, which was 65 and pH 5. These mutants increased the catalytic efficiency of beta 1,3 1,4 dextran and dextran by 0.5, 0.8 times respectively, and had good heat resistance and pH tolerance, so it was very promising in industry.
【技术实现步骤摘要】
内切葡聚糖酶NfEG12A突变体及其编码基因和应用
本专利技术涉及农业生物
，具体涉及内切葡聚糖酶NfEG12A突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
纤维素、半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要成分。纤维素是由吡喃葡萄糖以不同比例的β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的长链多糖聚合物。β-葡聚糖链通过分子内和分子间氢键的紧密排列形成不可溶的纤维素微丝。NfEG12A是一种偏高温酸性酶，最适温度65℃，最适pH5.0，是目前已知的该家族中酶活最高的酶，为了进一步提高其工业应用潜能，对该酶进行分子工程改造，以提高其催化水解纤维类底物的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供内切葡聚糖酶突变体NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W。本专利技术的再一目的是提供编码上述内切葡聚糖酶突变体的基因。本专利技术的另一目的是提供包含上述内切葡聚糖酶突变体基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述内切葡聚糖酶突变体基因的重组菌株。本专利技术的另一目的是提供一种制备上述内切葡聚糖酶突变体基因的基因工程方法。本专利技术的另一目的提供上述内切葡聚糖酶突变体的应用。本专利技术对内切葡聚糖酶NfEG12A进行定点突变，分别构建了突变体NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W。内切葡聚糖酶NfEG12A的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：(加粗氨基酸序列为信号肽，下划线氨基酸为突变位点)本专利技术在NfEG12A的7和111位点，通过定点突变构建了突变体NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W，所述突变体为内切葡聚糖酶NfEG12A的第7位的氨基酸Y、第111位的氨基酸Y分别或同时突变为W，从而使其对β-1,3-1,4-葡聚糖和木葡聚糖的催化效率分别提高了0.5-0.8和0.9-2.5倍，提升了其工业应用价值。根据本专利技术的具体实施方式，设计各突变引物，以编码内切葡聚糖酶NfEG12A基因的野生型质粒pPIC9γ-Nfeg12A为模板进行定点突变。纯化得到含有突变体密码子的质粒，并将其转化进毕赤酵母感受态细胞GS115中进行表达，得到重组突变体蛋白。本专利技术通过PCR的方式引入突变，获得突变体内切葡聚糖酶NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W。本专利技术还提供了包含上述内切葡聚糖酶基因的重组载体，命名为pPIC9γ-Nfeg12A-Y7W,pPIC9γ-Nfeg12A-Y111W,pPIC9γ-Nfeg12A-Y7/111W。将本专利技术所述的内切葡聚糖酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将本专利技术的内切葡聚糖酶基因插入到质粒pPIC9γ上的EorRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控。本专利技术还提供了包含上述基因的重组菌株，优选重组菌株为GS115/NfEG12A-Y7W,GS115/NfEG12A-Y111W，GS115/NfEG12A-Y7/111W。本专利技术还提供了一种制备内切葡聚糖酶突变体的方法，包括以下步骤：1)用上述的重组载体转化宿主细胞毕赤酵母GS115，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；3)回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶突变体。本专利技术还提供了上述内切葡聚糖酶突变体的应用。本专利技术的突变体NfEG12A-Y7W,NfEG12A-Y111W,NfEG12A-Y7/111W的最适温度与最适pH均与野生酶一致，为65℃和pH5.0，这些突变体对β-1,3-1,4-葡聚糖和木葡聚糖的催化效率分别提高了0.5-0.8倍，且具有良好的耐热性和pH耐受性，因此在工业中有非常可观的应用前景。附图说明图1显示图NfEG12A及其突变体的酶学性质测定；图2显示野生酶与突变酶的比活测定。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基：(1)NeosartoryafischeriP1.培养基为马铃薯培养基(1000ml)：200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(W/V)。(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH6.0。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例11.突变的构建突变体NfEG12A-Y7W、NfEG12A-Y111W、NfEG12A-Y7/111W是通过定点突变的方法构建的，电泳验证PCR结果，若有目标条带，加入1μLDMT酶于37℃下处理1h，以去除原质粒模板，后转化TransI-T1测序。2、各突变体载体转化毕赤酵母GS115及工程菌的筛选制备受体感受态细胞。用灭菌牙签从MD板上挑取单克隆，按先后次序标号，先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上；将两平板置于30℃培养箱中培养2天。按编号挑取正常生长的转化子接种于3mLBMGY培养基中，装有BMGY培养基的离心管需要严格无菌且包有八层纱布，将其置于30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液置于3000g离心10min，去上清，向离心管中加入1mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在30℃、260rpm诱导培养。诱导培养48h后，将菌液置于12000rpm离心3min，取上清检测活性，从中筛选出具有葡聚糖酶活性的转化子。将含有较高的内切葡聚糖酶酶活菌株接种于300mLBMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。3、本专利技术所述的突变内切葡糖酶活力的测定3.1内切葡聚糖酶的活性单位(U)定义：在给定的条件下，每分钟分解葡聚糖生成1μmolD-(+)-还原糖所需的酶量。3.2重组酶反应最适pH和pH稳定性的测定：将纯化好的重组内切葡聚糖酶在65℃下，不同pH的底物中进行酶学反应，以测定其最适pH。所用缓冲液为：pH2.0–8.0的McIlvaine缓冲液(0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸)，pH7.0–9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，以及pH10.0–12.0的Gly-NaOH缓冲液。pH稳定性测定：将浓缩后的纯酶液在不同pH值的缓冲液中置于37℃下处理1h，再用最适pH的缓冲液作适当稀释，在最适pH和最适温度的条件下测本文档来自技高网...
【技术保护点】
内切葡聚糖酶NfEG12A突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切葡聚糖酶NfEG12A的第7位和/或第111位的氨基酸Y突变为W。
【技术特征摘要】
1.内切葡聚糖酶NfEG12A突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的内切葡聚糖酶NfEG12A的第7位和/或第111位的氨基酸Y突变为W。2.内切葡聚糖酶NfEG12A突变体基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的内切葡聚糖酶NfEG12A突变体。3.包含权利要求2所述内切葡聚糖酶NfEG12A突变体基因的重...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，柏映国，杨虹，罗会颖，苏小运，王亚茹，涂涛，黄火清，孟坤，王苑，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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