基于慢病毒载体的日本脑炎免疫原性组合物制造技术

本发明专利技术涉及基于慢病毒载体的日本脑炎(JE)免疫原性组合物。本发明专利技术针对表达膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)，尤其是日本脑炎病毒(JEV)的糖蛋白或其免疫原性片段，的重组慢病毒载体。本发明专利技术还提供表达慢病毒载体的细胞，在哺乳动物宿主中防止JEV感染的应用和方法，所述宿主特别是人或动物宿主，具体是猪或小猪，优选家猪或家养小猪。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于慢病毒载体的日本脑炎免疫原性组合物
本专利技术涉及基于慢病毒载体的日本脑炎(JE)免疫原性组合物。本专利技术针对表达膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)的重组慢病毒载体，尤其是日本脑炎病毒(JEV)的糖蛋白或其免疫原性片段。本专利技术还提供表达慢病毒载体的细胞，在哺乳动物宿主中防止JEV感染的应用和方法，所述宿主特别是人或动物宿主，具体是猪或小猪，优选家猪或家养小猪。专利技术背景日本脑炎归因于蚊子传播的日本脑炎病毒(JEV)(黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒(Flavivirus)属成员)感染(Go等，2014；Hubalek等，2014；Weaver和Barrett，2004；Yun和Lee，2014)。JEV包含编码多蛋白的正单链RNA基因组，所述多蛋白加工成3个结构蛋白即衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)以及7个非结构蛋白即NS1到NS5(Yun和Lee，2014)。病毒组装在内质网膜腔中发生，在该处核衣壳与异二聚体prME相联形成不成熟的JEV病毒体。后者通过分泌途径转运，其中病毒体通过在转运高尔基体中由弗林蛋白酶将prM切割成膜(M)蛋白而变得成熟(Yun和Lee，2014)。另外，如同其它黄病毒，JEV产生病毒样颗粒(VLP)，其仅组装自prM和E蛋白，并经历与真病毒颗粒相同的成熟过程(Kuwahara和Konishi，2010)。这些VLP能在缺乏任何其它病毒组分的情况下产生并展示与真病毒体类似的生物活性(Kuwahara和Konishi，2010)。JEV通常在地方性动物并周期中在三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)蚊群之间维持并扩增于脊椎动物宿主，如水鸟和家猪(Go等，2014；Hubalek等，2014；Impoinvil等，2013)。马和人被认为是终宿主，因为它们不会发展出足以感染蚊子的病毒血症水平(Impoinvil等，2013)。在过去几十年中，JEV的亚洲地理分布出现扩张且近期报道了JEV可能已引入欧洲(Campbell等，2011；Zeller2012)。基于病毒包膜蛋白序列的系统发生研究可使JEV株分成基因型G1到G5(Gao等，2014；Hubalek等，2014；LeFlohic等，2013；Schuh等.，2013；Solomon等，2003；Weaver和Barrett，2004)。最初，大部分传播的JEV株属于G3且是东南亚国家主要流行病的源头。近期，在数个亚洲国家中观察到流行从JEVG3向G1转变，而一些JEVG5株偶尔在中国和韩国得到分离(Gao等，2013；LeFlohic等，2013；Li等，2014；Pan等，2011；Schuh等，2014；Takhampunya等，2011)。JEV是亚洲引起医学兴趣的最重要病毒性脑炎的病原体，每年发病率为50,000例和约10,000起死亡(Campbell等，2011；Go等，2014；Yun和Lee，2014)。约20-30％有症状的人病例是致命的，而30-50％非致命病例可能发展出长期神经病学后遗症。对于JE疾病没有可用的抗病毒治疗。针对JEV的疫苗目前可用于人和一些动物如马及猪：其是灭活的小鼠脑源性，灭活的细胞培养源性，活的减毒和活的减毒、嵌合黄热病病毒-JEV疫苗(Bonaparte等，2014；Dubischar-Kastner和Kanesan-Thasna，2012；Erra等,2013；Fan等，2013；Halstead和Thomas，2011；Impoinvil等，2013；Ishikawa等.，2014；Marks等，2012；Song等，2012；Yang等，2014；Yun和Lee，2014)。然而，其中一些缺乏长期免疫性且减毒活疫苗株可能有毒力回复的风险(Yun和Lee，2014)。JEV疫苗的成本效率也被认为是一个重要障碍(Impoinvil等，2013)。就基于基因的免疫而言，慢病毒载体代表一个新型和有吸引力的平台。慢病毒载体有效转导非分裂树突细胞(DC)的能力允许延长经内源通路的抗原呈递，其进而翻译成诱导强烈的、多表位和持久的体液以及细胞免疫应答。因此，越来越多的临床前试验显示慢病毒载体在传染性疾病和抗肿瘤疫苗接种领域中的高疫苗功效(Beignon等，2009；DiNunzio等，2012；Fontana等，2014；Grasso等，2013；Hu等，2011；Sakuma等，2012)。专利技术人先前证明整合和非整合的慢病毒载体都是有前途的疫苗接种载体，抵御虫媒病毒如西尼罗河病毒(WNV)，其属于黄病毒属的JE血清组(serocomplex)(Coutant等，2008；Iglesias等，2006)。这些报道首次证明慢病毒载体针对传染性病原引发保护性抗体应答的能力。实际上，用单次小剂量(singleminutedose)的重组慢病毒TRIP载体免疫可在小鼠中赋予针对WNV致死攻击的有力消毒保护，所述载体表达可溶型WNVE蛋白(Coutant等，2008；Iglesias等，2006)。体液免疫在保护免受JEV感染中发挥关键作用(Konishi，2013；Dubischar-Kastner和Kanesan-Thasna，2012)，因此，引起保护性抗体应答对开发安全JEV疫苗重要(Larena等，2013)。国际专利申请WO2005/111221涉及用于表达黄病毒蛋白的重组慢病毒载体以及其作为疫苗的应用。特别地，其描述重组慢病毒载体在制备免疫原性组合物中的应用以防止和/或治疗敏感物种的黄病毒感染，所述载体包括编码黄病毒科病毒的至少一种蛋白或所述蛋白的至少8个氨基酸的免疫原性肽的多核苷酸片段。国际专利申请WO2007/052165涉及慢病毒载体在制备药物中的应用，所述载体包括编码抗原的异源核酸且其中抗原在动物细胞内的表达引发所述动物的体液应答，所述药物能在给所述动物施用时产生抗体。例如，抗原表达诱发保护性免疫抵御黄病毒，即WNV。国际专利申请WO2009/019612涉及慢病毒基因转移载体和其医学应用。这些载体可用于引起免疫应答以防止或治疗发病状态(pathogenicstate)，包括病毒感染、寄生虫和细菌感染或癌症。所述慢病毒载体能包括编码至少一种来源于黄病毒，例如来自JEV的抗原多肽的多核苷酸。国际专利申请WO2005/06570涉及2个重组腺病毒(RAd)，即表达JEV的prM和膜锚定E蛋白(Ea)的RAdEa和表达JEV的prM和分泌性E蛋白(Es)的RAdEs。Kaur等(2002)描述了质粒pMEa和pMEs，其含有编码JEV的prM和所述Ea或Es的cDNA。考虑持续需要疫苗提供保护性体液免疫应答抵御JEV感染，包括抵御多种JEV基因型，专利技术人设计了表达选定的JEV蛋白质的新型慢病毒载体，所述选定的蛋白质被证明引起保护性免疫应答抵御具有不同基因型的一种或多种JEV。所得结果显示表达JEVprM和E蛋白的重组TRIP载体可在接种疫苗的小鼠中引发并加强抗原特异性、体液、广泛中和性应答。
技术实现思路
本专利技术涉及重组慢病毒载体基因组，包含慢病毒顺式活性元件、Ψ包装信号、Rev响应元件(RRE)和DNA垂悬部分(flap本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组慢病毒载体基因组，所述基因组包含慢病毒顺式活性元件、Ψ包装信号、Rev响应元件(RRE)和DNA垂悬部分中心多嘌呤序列(cPPT)/中央终止序列(CTS)，以及编码日本脑炎病毒(JEV)膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)或其免疫原性片段的转录单位，所述顺式活性元件包括长末端重复(LTR)或修饰的LTR，包括部分缺失的3’LTR。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.11 EP 14307008.41.一种重组慢病毒载体基因组，所述基因组包含慢病毒顺式活性元件、Ψ包装信号、Rev响应元件(RRE)和DNA垂悬部分中心多嘌呤序列(cPPT)/中央终止序列(CTS)，以及编码日本脑炎病毒(JEV)膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)或其免疫原性片段的转录单位，所述顺式活性元件包括长末端重复(LTR)或修饰的LTR，包括部分缺失的3’LTR。2.如权利要求1所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述E蛋白是全长E蛋白或缺失全长E蛋白的2个C末端跨膜结构域的其可溶形式。3.如权利要求1或2所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述慢病毒3’LTR中缺失U3区的启动子和激活子，且其中将编码prM和E蛋白的多核苷酸置于异源启动子控制下，例如巨细胞病毒立早(CMVie)启动子。4.如权利要求1-3中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述编码prM蛋白的多核苷酸具有SEQIDNO:5的序列且编码E蛋白的多核苷酸具有SEQIDNO:8或SEQIDNO:11的序列。5.如权利要求1-4中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述慢病毒载体基因组衍生自HIV，特别是HIV-1的基因组。6.如权利要求1-5中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述慢病毒载体基因组衍生自FIV基因组。7.如权利要求1-6中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其是因为所述慢病毒基因组的所有或部分gag和pol基因缺失或者所述慢病毒基因组的gag和pol基因突变，从而gag和pol基因不能编码功能性GAG和POL蛋白所致的复制缺陷型。8.如权利要求1-7中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其是核酸序列由SEQIDNO:34所限定的pTRIPΔU3.CMV/JEV.prME载体，或核酸序列由SEQIDNO:35所限定的pTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEΔTM载体。9.如权利要求1-8中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述prM和E编码序列是JEV基因型3(G3)的，例如JEVRP9株或JEV中山株。10.一种DNA质粒，所述质粒包含权利要求1-9中任一项所述的重组慢病毒载体基因组。11.一种宿主细胞，所述细胞用权利要求10所述的DNA质粒转染或遗传转化，特别地，其是HEK293T(人胚肾)细胞系。12.表达权利要求1-9中任一项所述重组慢病毒载体基因组的重组慢病毒载体颗粒，所述载体颗粒用水泡性口炎病毒糖蛋白G(VSV-G)蛋白质进行假型化，尤其是用VSV印第安纳株VSV-G或新泽西株的VSV蛋白进行假型化。13.如权利要求12所述的重组慢病毒载体颗粒，用作在哺乳动物中针对JEV感染的预防性治疗的活性成分，所述哺乳动物是动物或人。14.如权利要求13所述的重组慢病毒载体颗粒，其中所述动物是猪或小猪，特别是家猪或家养小猪。15.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·沙尔诺，P·德普雷，M·德维斯佩拉埃雷，P·苏克，MP·弗伦凯尔，
申请(专利权)人：巴斯德研究院，国立科学研究中心，
类型：发明
国别省市：法国,FR