一种准确测量昆虫肠道环境真实pH值的方法技术

本发明专利技术公开了一种准确测量昆虫肠道环境真实pH值的方法，该方法首先获取昆虫的肠道，收集一定量的昆虫肠道及其内容物，用生物组织研磨器磨碎昆虫肠道及其内容物，再通过冷冻离心机离心，获得昆虫肠道及其内容物上清液，用广泛pH试纸和精密pH试纸快速测量上清液pH值，即可获得昆虫肠道环境真实pH值，可在较短时间内准确获得某种昆虫幼虫肠道环境的真实pH值，为昆虫肠道微生物及肠道酶系的后续研究提供了方便，具有操作简单，测量数值真实可靠的特点。对昆虫的食物消化、营养获取以及研制与昆虫中肠有关的生物农药具有重要的指导价值。

A method for accurately measuring the real pH value of insect intestinal environment

The invention discloses a method for accurate measurement of the true pH value of the insect intestinal environment. This method first obtains the intestinal tract of insects, collects a certain amount of insect intestines and its contents, ground the insect intestines and its contents with a biological tissue grinder, and then centrifuge by the frozen centrifuge to obtain the supernatant of the insect intestines and its content. The real pH value of the insect intestinal environment can be obtained by the rapid measurement of the pH value of the supernatant by the wide pH test paper and the precision pH test paper. The true pH value of the intestinal environment of some insect larvae can be obtained in a short time. It is convenient for the follow-up study of the insect intestinal microorganism and the intestinal enzyme system. It has simple operation and the measurement value is true. A real and reliable feature. It has important guiding value for insect food digestion, nutrition acquisition and development of biological pesticides related to insect midgut.

【技术实现步骤摘要】
一种准确测量昆虫肠道环境真实pH值的方法
本专利技术属于昆虫肠道环境测定技术，具体涉及一种准确测量昆虫肠道环境真实pH值的方法。
技术介绍
昆虫的消化道主要有消化食物颗粒、吸收营养物质、维持体内离子平衡和排出代谢废物的功能。依据功能不同分为前肠、中肠和后场。其中，前肠具有用于临时贮存食物的嗉囊，中肠是肠道共生物及消化酶和蛋白酶主要存在的场所，功能最为突出。中肠主要分泌消化液、消化食物和吸收营养。后肠(包括回肠和直肠)主要功能是排除含氮的代谢废物和食物残渣，同时为昆虫肠道菌群提供有利的营养环境。昆虫肠道是昆虫消化系统最主要的组成部分，是伴随昆虫各种生命代谢活动的动态且稳定的环境，昆虫复杂的肠道环境为某些微生物提供了一个优越的定殖环境。肠道环境中存在着大量的肠道微生物，部分研究表明这些微生物的存在对寄主昆虫正常生命活动意义重大。大多数微生物与寄主昆虫是互利共生关系，它们含有多种酶系统，在维生素的合成、脂肪和碳水化合物的吸收和利用中也起着重要作用。肠道微生物和昆虫的肠道相互影响最终达到动态平衡，从而使昆虫的肠道环境维持在一个恒定的pH值。因昆虫具有多样化的生态习性和不同取食特性，不同种类昆虫的肠道菌群也出现多样化的特性。肠道环境因昆虫的种类不同而差异很大，这也是昆虫适应各种不同生态位和取食习惯的长期协同进化结果，这种协同进化逐渐演化为昆虫特定肠道部位定居固定肠道微生物的现象。因此，不同种类的昆虫肠道中定殖着不同的肠道微生物，肠道微生物的种类会影响肠道环境的实际pH值，取食不同的寄主植物也会在一定程度上影响肠道环境的真实pH值。肠道环境稳定的pH值在昆虫维持正常的生理活动方面具有及其重要的功能，稳定的肠道环境pH值可在一定程度上抵御外来菌的侵入与定殖，在促进免疫系统的发挥功能中也起着重要作用。昆虫体内大多数蛋白酶和肽酶会直接分泌到中肠，其中一些昆虫体内的酶系统则会保留在其中肠细胞或与其外膜结合处，因此，肠腔内的pH值可直接影响酶活性水平，其影响程度取决于酶活性发挥的最佳pH值。而不同种类昆虫之间肠道pH环境差异很大。在昆虫肠道的真实pH值的条件下研究昆虫的肠道酶活性更具有实际应用价值，才更能反映真实酶活性变化。昆虫肠道环境中的酶种类繁多，近年来研究最多的有消化酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、羧酸酯酶、海藻糖酶以及各种中肠受体蛋白等。这一系列酶功能的发挥在维持昆虫正常新陈代谢和生理活动中作用显著，而昆虫肠道环境的真实pH值对酶的活性有直接的影响。这一系列和昆虫肠道有关的酶活性的研究必须建立在昆虫肠道环境的真实pH值的基础上才更有实际参考价值。近年来对昆虫肠道微生物和昆虫体内一系列酶活性方面的研究已成为学者们普遍关注的新热点。因此，研究一种能快速的测出昆虫肠道真实准确的pH值的方法在昆虫的生理生化研究方面就显得尤为重要，此方法对昆虫的食物消化、营养获取以及研制与昆虫中肠有关的生物农药具有重要的指导价值。现有的关于测昆虫肠道pH值相关的常规方法主要有以下两类，黄淑娟等(2009)在《pH对红褐斑腿蝗中肠主要蛋白酶活性的影响》这篇文献中的方法是：“迅速剪取中肠部分并用2mL超纯水将中肠及其内含物洗脱在小烧杯里，立即在室温下用pH计测量其中肠肠液的pH值。”pH是氢离子浓度指数(hydrogenionconcentration)是指溶液中氢离子的总数和总物质的量的比。此方法中将中肠及其内含物用2mL超纯水洗脱在烧杯中再测出的pH值，因在肠道原液中加入了超纯水导致肠道液中原有的H离子浓度被稀释，因此测的值不能反映肠道真实pH值。王深柱等发表的文章：《棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的鉴定》，(昆虫学报，第39卷，第1期，1996年2月)，及赵爱平等表的文章：《蛋白酶抑制剂对梨小食心虫幼虫中肠蛋白酶活性的影响》(昆虫学报，2016年59卷10期，1069-1078)，文中的方法均是：通过在pH值5.5—11.0范围内设置多个不同浓度梯度的缓冲液中分别测酶活性，并将酶活性最高的那个pH确定为最适pH值；该方法不仅工作量大而且测出的结果不能反映真实肠道pH值条件下的酶活性。
技术实现思路
鉴于以上研究背景中存在技术问题，本专利技术的目的在于，提供一种准确测量昆虫肠道环境真实pH的方法。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种准确测量昆虫肠道环境真实pH值的方法，其特征在于，按照下列步骤进行：步骤一，取经速冻的昆虫幼虫30头(数量依据不同种类的昆虫幼虫的大小可适当调整)，将虫体放在冰上固定，迅速用剪刀沿昆虫幼虫的腹中线剪开体壁，暴露出整个消化道组织，用手术刀片从昆虫幼虫食道前端切断消化道，再切断后肠后端的消化道，然后用镊子分离出昆虫幼虫整个肠道及其内容物；步骤二，将解剖出的肠道及其内容物组织放入1.5mL的EP管，直至EP管中的肠道及其内容物组织体积达0.2mL，然后将装有肠道及其内容物的EP管用生物组织研磨器在冰上磨碎肠道及其内容物；步骤三，将含有肠道及其内容物的EP管放入冷冻离心机，在4℃、12000rpm下离心20min；步骤四，用玻璃棒蘸取离心后的EP管中的上清液点于广泛pH试纸上，半秒钟后与标准色板比较，读出pH值，确定pH的范围；之后用同样方法在精密pH试纸上读出精确的pH值；此精密pH试纸上读出的pH值即为该种昆虫幼虫的肠道环境的真实pH值。采用本专利技术的快速测量昆虫肠道环境真实pH值的方法，可在较短时间内准确获得某种昆虫幼虫肠道环境的真实pH值，为昆虫肠道微生物及肠道酶系的后续研究提供了方便，具有操作简单，测量数值真实可靠的特点。对昆虫的食物消化、营养获取以及研制与昆虫中肠有关的生物农药具有重要的指导价值。具体实施方式为了清楚的理解本专利技术，以下结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。本实施例以寄主为桃树叶片的苹小卷叶蛾的肠道真实pH值的测量为例，需要说明的是，本专利技术不限于该实施例。在以下的实施例中，为测量昆虫肠道环境真实pH值，专利技术人采集同一种桃树上寄主为桃树叶片的健康4龄苹小卷叶蛾幼虫，采集后按照常规的方法进行速冻，然后取出昆虫的肠道，收集一定量的肠道及其内容物，用生物组织研磨器磨碎肠道及其内容物，再通过高速离心获得肠道及其内容物的上清液，继而测量肠道真实pH值。具体操作步骤如下：1、取经速冻的苹小卷叶蛾幼虫30头，将虫体放在冰浴上冷却固定。2、迅速在冰上用剪刀沿苹小卷叶蛾幼虫的腹中线剪开体壁，暴露出整个消化道组织，用手术刀片从苹小卷叶蛾幼虫食道前端切断消化道，再切断后肠后端的消化道，然后用镊子分离出苹小卷叶蛾幼虫整个肠道及其内容物。3、将解剖出的肠道及其内容物组织立即放入1.5mL的EP管，直至EP管中的幼虫的肠道及其内容物组织的体积达0.2mL，然后将装有肠道及其内容物组织的EP管用生物组织研磨器在冰上磨碎肠道及其内容物。4、将装有肠道及其内容物的EP管放入冷冻离心机，在4℃、12000rpm下离心20min。5、用玻璃棒蘸取上离心后的EP管中的清液，点于广泛pH试纸上，半秒钟后与标准色板比较，读出pH值为7.0，确定pH的范围6.0-8.0之间，之后用同样方法在精密pH试纸上读出精确的pH值为6.5。精密pH试纸上读出的pH值即为寄主为桃树叶片的苹小卷叶蛾幼虫的肠道环境的真实pH值。当然，对于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种准确测量昆虫肠道环境真实pH值的方法，其特征在于，按照下列步骤进行：步骤一，取经速冻的昆虫幼虫30头，将虫体放在冰上固定，迅速用剪刀沿昆虫幼虫的腹中线剪开体壁，暴露出整个消化道组织，用手术刀片从昆虫幼虫食道前端切断消化道，再切断后肠后端的消化道，然后用镊子分离出昆虫幼虫整个肠道及其内容物；步骤二，将解剖出的肠道及其内容物组织放入1.5mL的EP管，直至EP管中的肠道及其内容物组织体积达0.2mL，然后将装有肠道及其内容物的EP管用生物组织研磨器在冰上磨碎肠道及其内容物；步骤三，将含有肠道及其内容物的EP管放入冷冻离心机，在4℃、12000rpm下离心20min；步骤四，用玻璃棒蘸取离心后的EP管中的上清液点于广泛pH试纸上，半秒钟后与标准色板比较，读出pH值，确定pH的范围；之后用同样方法在精密pH试纸上读出精确的pH值；此精密pH试纸上读出的pH值即为该种昆虫幼虫的肠道环境的真实pH值。

【技术特征摘要】
1.一种准确测量昆虫肠道环境真实pH值的方法，其特征在于，按照下列步骤进行：步骤一，取经速冻的昆虫幼虫30头，将虫体放在冰上固定，迅速用剪刀沿昆虫幼虫的腹中线剪开体壁，暴露出整个消化道组织，用手术刀片从昆虫幼虫食道前端切断消化道，再切断后肠后端的消化道，然后用镊子分离出昆虫幼虫整个肠道及其内容物；步骤二，将解剖出的肠道及其内容物组织放入1.5mL的EP管，直至EP管中的肠道及其内容物组织体积达0.2m...

【专利技术属性】
技术研发人员：李怡萍，李引，仵均祥，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61