一种利用表面阳离子化的R-藻红蛋白检测DNA杂交的方法技术

本发明专利技术属于核酸检测技术领域，公开了一种利用表面阳离子化的R‑藻红蛋白检测DNA杂交的方法。所述方法的具体步骤如下：将R‑藻红蛋白离心超滤后脱盐并稀释；然后加入阳离子聚合物PDADMAC将蛋白表面正电荷化；加入带有猝灭基团BHQ2修饰的DNA单链，荧光被猝灭高达88％左右；加入不同浓度的完全互补链后荧光不断释放。本发明专利技术的优点是：选用天然植物蛋白R‑PE与BHQ2修饰的核酸链作为荧光共振能量转移的供体和受体，加入阳离子聚合物可以提高FRET效率，当自由态时，荧光被猝灭，一旦与靶目标链相结合，荧光随即恢复，灵敏度高，由此来达到DNA杂交检测的目的。

A method for detecting DNA hybridization by surface cationic R- phycoerythroprotein

The invention belongs to the field of nucleic acid detection technology, and discloses a method for detecting DNA hybridization by surface cationic R algin. The specific steps of the method are as follows: desalination and dilution of R alga red protein after ultrafiltration; then the cationic polymer PDADMAC is added to the positive charge of the protein surface, and the fluorescence is quenched by about 88% by adding the DNA single chain with the quenching group BHQ2 modified, and the fluorescence is released continuously after the addition of the full complementary chain with different concentrations. The advantages of the invention are: using the natural plant protein R PE and BHQ2 modified nucleic acid chain as the donor and receptor of the energy transfer of the fluorescence resonance, adding the cationic polymer can improve the efficiency of the FRET. When the free state, the fluorescence is quenched. Once the target chain is combined, the fluorescence is immediately restored and the sensitivity is high, thus reaching the high sensitivity. The purpose of DNA hybridization detection.

【技术实现步骤摘要】
一种利用表面阳离子化的R-藻红蛋白检测DNA杂交的方法
：本专利技术属于核酸检测领域，具体涉及一种利用表面阳离子化的R-藻红蛋白检测DNA杂交的方法。
技术介绍
：R-藻红蛋白(R-phycoerythrin)是从海藻中分离纯化提取的，是一种目前普遍使用的新型荧光标记材料，其荧光强度是荧光素的30-100倍，具有很好的吸光性能和很高的量子产率。将藻红蛋白用于荧光分析，具有传统化学荧光染料无法比拟的优越性：1、在较宽的PH范围内具有较宽的吸收光谱，比较容易选择合适的激发波长，从而得到高效荧光发射，且激发时有特异的荧光发射峰；2、吸光度和荧光量子产率很高，荧光强而稳定，灵敏度高；3、具有较小的荧光背景，不易淬灭，荧光保存期较长；4、水溶性极佳，易于其他分子交联结合，非特异性吸附少；5、纯天然海洋生物提取，无任何毒副作用，不含放射性，操作使用非常安全。PDADMAC(Polydimethyldiallylammoniumchloride)聚二甲基二烯丙基氯化铵，是一种化学物质。本品为强阳离子聚电解质，外观为无色至淡黄色粘稠液体。安全、无毒、易溶于水、不易燃、凝聚力强、水解稳定性好、不成凝胶，对pH值变化不敏感，有抗氯性。凝固点约-2.8℃，比重约1.04g/cm，分解温度280-300℃，且其本身对藻红蛋白的荧光特性无任何影响。目前，开发DNA杂交检测方法的研究已经成为国内外的热点，其中最多的是利用纳米材料来检测，如金胶、量子点、碳纳米管、上转换纳米颗粒等。HPeng等人利用蓝色量子点与染料标记的单链DNA合成探针来检测DNA的杂交(PengH,ZhangL,TH,etal.DNAhybridizationdetectionwithblueluminescentquantumdotsanddye-labeledsingle-strandedDNA[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2007,129(11):3048-9.)。RYang等人利用碳纳米管荧光猝灭单核苷酸探针来实现对DNA杂交的检测(YangR,JinJ,ChenY,etal.Carbonnanotube-quenchedfluorescentoligonucleotides:probesthatfluoresceuponhybridization.[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2008,130(26):8351.)。HLi等人利用非修饰的金纳米颗粒与DNA序列之间的静电相互作用，通过比色法实现了DNA杂交的检测(LiH,RothbergL.ColorimetricdetectionofDNAsequencesbasedonelectrostaticinteractionswithunmodifiedgoldnanoparticles.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004,101(39):14036.)。迄今为止，利用荧光蛋白来检测DNA杂交的技术还没有涉及。因此，本专利专利技术了一种新的检测DNA杂交的方法，即利用表面阳离子化的藻红蛋白来检测DNA杂交。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种新的DNA杂交检测的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种将R-藻红蛋白表面阳离子化，之后用来检测DNA杂交的方法。首先涉及到将R-藻红蛋白表面阳离子化的方法，包括以下步骤：(1)将R-藻红蛋白在4℃下离心超滤脱盐；(2)将藻红蛋白的浓度用PBS缓冲液稀释为1mg/mL；(3)将阳离子聚合物PDADMAC(weight<100000，35wt.％inH2O)用PBS缓冲液稀释10倍；(4)将R-PE与PDADMAC以体积比1:10的比例混合均匀。步骤(1)～(4)中所用的缓冲液为50mMPBS缓冲液，pH＝7.5；步骤(1)中所述的离心条件优选为3800rcf，离心25～30min；步骤(1)中所述的超滤次数优选为4～5次，超滤管为100kD；其次涉及到DNA杂交检测的方法，包括以下步骤：(a)用荧光光谱仪测量表面阳离子化的R-PE在575nm处的荧光强度；(b)将表面阳离子化的R-PE与猝灭基团BHQ2修饰的DNA链以1:5的比例混合反应2分钟，测量其在575nm处的荧光强度；(c)将BHQ2修饰的DNA链与其完全互补链以不同的比例混合均匀，之后加入表面阳离子化的R-PE，2分钟后测量其在575nm处的荧光强度；(d)将BHQ2修饰的DNA单链与单碱基错配的互补链以1:1的比例混合均匀，之后加入表面阳离子化的R-PE，2分钟后测量其在575nm处的荧光强度。步骤(a)～(d)中测量荧光强度的仪器为为爱丁堡一体化稳态瞬态荧光光谱仪FS5，其检测灵敏度高；步骤(b)中DNA链的序列为：5'-TACGAGTTGAGAATCCTGAATGCG-BHQ2-3’，也可为其他序列；步骤(c)中的DNA互补链的序列为：5'-ATGCTCAACTCTTAGGACTTACGC-3'，其序列根据步骤(b)中的序列变换；步骤(d)中的单碱基错配DNA互补链序列为：5'-ATGCTCAACTCGTAGGACTTACGC-3'，其序列根据步骤(b)中的序列变换与现有的DNA杂交检测技术相比，本专利技术的优点在于：(1)R-藻红蛋白是一种天然的植物蛋白，本身无毒性，与其他纳米颗粒相比价格低廉易获取；(2)与其他常用方法相比，本专利技术样品制备时间短、步骤简单。(3)检测灵敏度高，检测限低。附图说明图1是DNA杂交检测的原理图。图2是阳离子聚合物PDADMAC对R-PE本身的荧光强度的影响图。图3是猝灭基团BHQ2修饰的单链DNA对荧光强度的影响图。图4是加入不同浓度的完全互补链的荧光释放图。图5是加入完全互补链(a)、单碱基错配链(b)、仅DNA单链(c)后的荧光图。具体实施方式为了能够更清楚的理解本专利技术的
技术实现思路
，下面对本专利技术的具体实施方法作进一步说明。实施例一：各种溶液的制备(1)50mMPBS缓冲液的制备29.0gNa2HPO4-12H2O,2.9gNaH2PO4-2H2O,5.85gNaCl溶于900ml的超纯水中，定容至1000ml容量瓶中，之后将其稀释2倍，此时浓度即为50mM。(2)藻红蛋白溶液的制备移取100μL藻红蛋白晶体，3800rcf4℃离心15min，移弃上清，沉淀部分用500μL50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)溶解30min；选择滤膜为100kD的超滤管；3800rcf4℃离心超滤15min脱盐，重复超滤脱盐4次，之后用PBS缓冲液(pH＝7.5)将浓度稀释为1mg/mL。(3)阳离子聚合物PDADMAC溶液的制备用PBS缓冲液将PDADMAC(weight<100000，35wt.％inH2O)溶液稀释10倍，此时浓度为50mM。(4)BHQ2修饰的DNA单链的溶液的制备将合成的DNA链在开盖之前先进行离心，转速为4000rpm，时间为30～60s。之后每OD加入44.5μL的PBS缓冲液，将其配成100μM的储备液放在4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用表面阳离子化的R‑藻红蛋白检测DNA杂交的方法，其特征在于：(1)将R‑藻红蛋白在4℃下离心超滤脱盐；(2)将R‑藻红蛋白与阳离子聚合物PDADMAC(weight<100000，35wt.％in H2O)以1:50(摩尔浓度)的比例混合均匀；(3)用爱丁堡一体化稳态瞬态荧光光谱仪FS5分别检测阳离子化前后的R‑藻红蛋白荧光强度；(4)将(2)的混合溶液与猝灭基团BHQ2修饰的DNA单链溶液以1:5(摩尔浓度)的比例混合均匀并稀释至100μL，静置2分钟后测量其荧光强度，观察到荧光猝灭88％左右；(5)将猝灭基团BHQ2修饰的DNA单链溶液与未修饰的完全互补链溶液以1:1(摩尔浓度)的比例混合均匀，然后将(2)的溶液与其以1:5(摩尔浓度)的比例混合均匀并稀释至100μL，静置2分钟后测量其荧光强度，观察到荧光强度基本没有发生变化；(6)将猝灭基团BHQ2修饰的DNA单链溶液与未修饰的完全互补链溶液分别以5:1，5:2，5:3，5:4，1:1(摩尔浓度)的比例混合均匀，然后将(2)的溶液与其以1:5(摩尔浓度)的比例混合均匀并稀释至100μL，静置2分钟后测量其荧光强度，观察到荧光强度逐渐释放，最终与R‑藻红蛋白的荧光强度基本相同；(7)将猝灭基团BHQ2修饰的DNA单链溶液与未修饰的单碱基错配互补链溶液以1:1(摩尔浓度)的比例混合均匀，然后将(2)的溶液与其以1:5(摩尔浓度)的比例混合均匀并稀释至100μL，静置2分钟后测量其荧光强度，观察到荧光强度猝灭20％左右。...

【技术特征摘要】
1.一种利用表面阳离子化的R-藻红蛋白检测DNA杂交的方法，其特征在于：(1)将R-藻红蛋白在4℃下离心超滤脱盐；(2)将R-藻红蛋白与阳离子聚合物PDADMAC(weight&lt;100000，35wt.％inH2O)以1:50(摩尔浓度)的比例混合均匀；(3)用爱丁堡一体化稳态瞬态荧光光谱仪FS5分别检测阳离子化前后的R-藻红蛋白荧光强度；(4)将(2)的混合溶液与猝灭基团BHQ2修饰的DNA单链溶液以1:5(摩尔浓度)的比例混合均匀并稀释至100μL，静置2分钟后测量其荧光强度，观察到荧光猝灭88％左右；(5)将猝灭基团BHQ2修饰的DNA单链溶液与未修饰的完全互补链溶液以1:1(摩尔浓度)的比例混合均匀，然后将(2)的溶液与其以1:5(摩尔浓度)的比例混合均匀并稀释至100μL，静置2分钟后测量其荧光强度，观察到荧光强度基本没有发生变化；(6)将猝灭基团BHQ2修饰的DNA单链溶液与未修饰的完全互补链溶液分别以5:1，5:2，5:3，5:4，1:1(摩尔浓度)的比例混合均匀，然后将(2)的溶液与其以1:5(摩尔浓度)的比例混合均匀并稀释至100μL，静置2分钟后测量其荧光强度，观察到荧光强度逐渐释放，最终与R-藻红蛋白的荧光强度基本相同；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴继魁，陆云飞，任宁娜，张俊玲，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31