发酵生产二十二碳六烯酸的改进方法技术

本发明专利技术包括在高含氧条件下，通过固态发酵或者分批、半连续或连续的深层发酵，由破囊壶菌(Thraustochytriales)生产多不饱和脂肪酸的方法。在发酵刚开始时添加大于200g/L和直到450g/L的葡萄糖，进行分批发酵得到产量大于10g/L的DHA。该方法包括保持至少20％～30％的溶解氧，有时高达50％左右或以上。

An improved method for the fermentation of twenty-two - C - six - enoic acid

The invention includes a method of producing polyunsaturated fatty acids by solid fermentation or by solid fermentation, batch, semi continuous or continuous deep fermentation by Thraustochytriales. At the beginning of fermentation, glucose was added more than 200g/L and until 450g/L, and DHA was produced by batch fermentation to yield more than 10g/L. The method includes maintaining at least 20% to 30% dissolved oxygen, sometimes up to 50% or more.

【技术实现步骤摘要】
发酵生产二十二碳六烯酸的改进方法本申请要求2009年2月25日提交的印度专利申请428/MUM/2009的优先权；本申请是2010年2月24日提交的中国专利申请No.201080009447.5的分案申请。
本专利技术涉及发酵生产二十二碳六烯酸的改进方法。更具体的，其涉及含有豆粕(soybeanmeal)和其它用于促进脂肪生产的营养成分的培养基组合物，更具体的，涉及在液体以及固体培养基中由破囊壶菌(Thraustochytriales)分批发酵生产的多不饱和脂肪酸。本专利技术还涉及发酵生产二十二碳六烯酸的新方法。
技术介绍
必需脂肪酸是指那些在有机体的健康中必不可少，但动物/人体又不能合成，而必须通过食物来源提供的脂肪酸。ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸即属于这类脂肪酸，它们在大脑功能以及正常生长和发育中发挥着至关重要的作用。这两种必需脂肪酸属于多不饱和脂肪酸(PUFA)，在刺激皮肤和毛发生长、维持骨骼健康、调节新陈代谢和保持生殖能力中通常是必需的。在ω-3的位置具有一个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸家族被称为ω-3脂肪酸。分别在18、20或22个碳原子碳链的顺式构型中具有3、5或6个双键的α-亚麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，被认为是对人类营养具有重要作用的ω-3脂肪酸。在ω-3脂肪酸中，长链-PUFA，也缩写成LC-PUFA，按照定义，是指链长超过18个碳原子且含有两个或更多双键的脂肪酸。一种在婴儿营养中具有重要作用的脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。这种脂肪酸在人类乳汁中存在的浓度很低。足月儿和早产儿都可以从各自的必需脂肪酸中合成LC-PUFA，但争议集中在母乳喂养的婴儿比配方奶喂养的婴儿具有更高的DHA血浆浓度的事实上。该信息被解读为意味着配方奶喂养的婴儿不能合成足够的DHA以满足持续的需求(参见“Ashore-baseddietrichinenergyand‘brain-specific’nutrientsmadehumanbrainevolutionpossible”(“富含能量的岸基饮食和脑特异性营养品使人类大脑进化成为可能”):ProceedingsoftheGhentConferenceonWaterandHumanEvolutionbyStephenC.CunnaneDepartmentofNutritionalSciences,UniversityofToronto,inhttp://users.ugent.be/～mvaneech/Cunnane.html)。美国国立健康研究院公布了推荐的脂肪酸每日摄入量。根据公布，EPA与DHA推荐的摄入量为650mg/d，α-亚麻酸为2.22g/d和亚麻酸为4.44g/d，且饱和脂肪推荐摄入量为不超过总热量摄入量的8％或约18g/d。EPA和DHA的唯一可行的常规来源是鱼，且仅是被称为“油鱼”特定种类的鱼。为了满足推荐的DHA每日需求，美国心脏协会的推荐书(http://www.americanheart.org/presenter.jhtml？identifier＝4632)发布了一个科学公告：“我们建议每周至少食用2次鱼(尤其是富含脂肪的鱼)。——富含脂肪的鱼类，如鲭鱼、湖红点鲑、鲱鱼、沙丁鱼、长鳍金枪鱼和鲑鱼富含两种ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。——我们还推荐食用豆腐和大豆、油菜籽、核桃和亚麻子等其它形式以及它们的油。它们含有α-亚麻酸(LNA)，其可以在体内变成ω-3脂肪酸。然而，这种修饰的程度是适度的并存在有争议。需要更多的研究来表明α-亚麻酸和心脏病之间的因果关系。”然而，几乎没有一个可行的来源以满足潜在的需求，因为需求高于通过食用油鱼获得的补给。极少数美国人能为自己得到这种配额，原因主要有两个，可获得性和成本。因此，从生态可持续性的观点来看，鱼不是膳食DHA的可行供给来源。此外，已知鱼含有高含量的汞，而这也限制了它的摄入量，并禁止儿童和孕妇食用。进一步地，鱼类还含有约六倍量的ω-6脂肪酸，从而抵消了DHA的治疗作用。鉴于传统的DHA来源不足，海洋原生生物已经成为焦点，通过其异养生产DHA作为DHA的替代来源。因此，改良这些有机体(organism)的异养生产效率来生产DHA是非常理想的。现有技术US5340742要求保护一种培养破囊壶菌(Thraustochytrium)、裂殖壶菌(Schizochytrium)及其混合物的方法，其培养基中含有小于约3克氯化物/升所述培养基、碳源、氮源、微量营养素和非氯化物钠盐，温度约5℃至约48℃，pH值约5.0至约11.0。Kyle等人在US5407957中描述了一种方法，其中单细胞食用油含有至少约20％甘油三酯形式的二十二碳六烯酸(DHA)，该方法包括在含有营养液的通气发酵罐中培养能产生所述单细胞油的沟鞭藻纲(Dinophyceae)异养微藻，所述营养液具有限制性的氮源和至少约10％空气饱和水平的氧水平，并继续培养至每升营养液的细胞密度达到至少约10克生物质(biomass)。Kumar等人在US6410282中描述了一种在破囊壶菌属(Thraustochytrid)真菌中能增加二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸水平的方法，其通过在培养基中于25℃～30℃培养破囊壶菌属真菌菌株UlkeniaradiataGaertner2至5天，该菌株保藏在日本生物科学与人类技术国立研究所，登记号为No.AB22115；将破囊壶菌属真菌菌株接种于含有0.1至1％聚乙烯吡咯烷酮的培养基中，在25℃至30℃培养3天；离心收集细胞，从细胞中提取含量增加的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。US6451567描述了一种通过在发酵培养基中生长广盐性微生物来生产脂类的方法，其中所述广盐性微生物每天每升发酵培养基能生产约1.08克长链ω-3脂肪酸。培养基由40克糖/升发酵培养基组成，钠离子浓度为发酵培养基中60％海水。该方法进一步公开广盐性微生物的指数增长率在25℃下和30℃下分别为每天至少约5倍和每天7倍。Barclay在US6566123中报道了包括选自破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物菌群的生物质，其中所述微生物菌群通过如下方法产生：在约5℃至约48℃的温度下，在含有小于约3克氯化物/升所述培养基、碳源、氮源和营养物质以及非氯化物钠盐的培养基中，使所述微生物菌群生长。Bailey等人在US6607900中描述了以破囊壶菌目的微生物进行补料分批发酵生产含多烯脂肪酸的脂类的方法，产生至少约20％其干细胞重作为脂类，该方法包括向包括所述微生物的发酵培养基中，以足以使所述发酵培养基的生物质密度增加到每升至少约100克干细胞重的速率，加入无酒精碳源和氮源，其中所述方法包括生物质密度增加阶段和脂类生产阶段，其中在所述生物质密度增加阶段，所述发酵培养基中的溶解氧水平在所述发酵培养基中至少约为4％的饱和度，且在所述脂类生产阶段，所述发酵培养基中的溶解氧水平在所述发酵培养基中小于约3％的饱和度。Barclay在US7005280中报道了一种用于生产脂类的方法，包括：(a)使破囊壶菌目微生物在发酵培养基中生长；以及(b)从所述微生物中提取脂类，其中所述脂类含有作为C22：6n-3(D本文档来自技高网...

【技术保护点】
在高含氧条件下由破囊壶菌目微生物(Thraustochytriales)生产多不饱和脂肪酸的方法，其包括分批发酵、半连续发酵或连续发酵，且包括以下步骤：通过最初增加搅拌器搅拌头速度至高达3.2m/sec来保持溶解氧水平为20‑30％；在发酵后期，溶解氧开始下降，除了以所述搅拌头速度进行搅拌还通过将发酵罐切换到气体混合模式来恢复所述溶解氧水平，其中将纯氧与空气混合并喷入发酵罐的发酵液中，以阻止所述溶解氧下降到低于目标水平，所述目标水平在整个发酵过程中为15％饱和度或以上。

【技术特征摘要】
2009.02.25 IN 428/MUM/20091.在高含氧条件下由破囊壶菌目微生物(Thraustochytriales)生产多不饱和脂肪酸的方法，其包括分批发酵、半连续发酵或连续发酵，且包括以下步骤：通过最初增加搅拌器搅拌头速度至高达3.2m/sec来保持溶解氧水平为20-30％；在发酵后期，溶解氧开始下降，除了以所述搅拌头速度进行搅拌还通过将发酵罐切换到气体混合模式来恢复所述溶解氧水平，其中将纯氧与空气混合并喷入发酵罐的发酵液中，以阻止所述溶解氧下降到低于目标水平，所述目标水平在整个发酵过程中为15％饱和度或以上。2.根据权利要求1所述的方法，其包括分批发酵，其中通过保持发酵液中的溶解氧为至少20％，获得的DHA产量大于10g/L。3.根据权利要求1所述的方法，其中在分批发酵中，添加无机氮，并补充添加来自含氨基化合物的有机氮。4.根据权利要求3所述的方法，其中在分批发酵中，来自所述含氨基化合物的有机氮包括尿素、富含蛋白的来源或富含肽的来源或者氨基酸。5.根据权利要求4所述的方法，其中在分批发酵中，所述富含蛋白的来源包括脱脂大豆粉。6.根据权利要求1所述的方法，其包括添加消泡剂。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述半连续发酵包括以下步骤：a.在第一发酵罐中，使一批发酵液发酵达到其中微生物在对数生长期处于活跃分裂状态的点，b.在第一发酵罐中保留一部分发酵液，其体积足以给下一批...

【专利技术属性】
技术研发人员：奈克旭·拉特兰，桑迪普·奥罗拉，苏伦德拉·塔卢里，艾拉潘·甘尼森，维尼塔·皮特，
申请(专利权)人：VB医疗私人有限公司，
类型：发明
国别省市：印度,IN