一种紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种紫外诱导的桑叶中Diels‑Alderase酶的分离纯化方法及其用途。所述制备方法包括以下步骤：(1)选取新鲜采摘桑叶，经紫外诱导后匀浆；(2)离心后所得粗酶液经硫酸铵沉淀收集硫酸铵沉淀部分；(3)沉淀经缓冲液复溶后，样品经过疏水性层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析分离，浓缩后得到目标蛋白Diels‑Alderase酶。本发明专利技术提供的从紫外诱导桑叶中获得的Diels‑Alderase酶不仅纯度高且活性保持良好；Diels‑Alderase酶具有高效催化合成chalcomoracin的作用；chalcomoracin具有显著的抗肿瘤活性，可应用于制备新型抗肿瘤药物。

A UV induced isolation and purification method of Diels-Alderase enzyme from mulberry leaves and its application

The invention discloses a method for separating and purifying Diels - Alderase enzyme in mulberry leaves induced by ultraviolet and its application. The preparation method comprises the following steps: (1) select the fresh plucking mulberry leaves and induce the homogenate after ultraviolet induction; (2) the crude enzyme is precipitated by ammonium sulfate to collect the ammonium sulfate precipitation part after the centrifugation; (3) after the precipitation of the buffer solution, the sample passes through hydrophobic chromatography, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography and gel filtration layer. After separation and concentration, the target protein Diels Alderase enzyme was obtained. The Diels Alderase enzyme obtained from the ultraviolet induced mulberry leaves not only has high purity and good activity, but also the Diels Alderase enzyme has the effect of highly efficient catalytic synthesis of chalcomoracin; chalcomoracin has significant antitumor activity and can be applied to the preparation of a new anti swelling tumor drug.

【技术实现步骤摘要】
一种紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法及其用途
本专利技术属于酶分离纯化
，涉及一种桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法及其用途。
技术介绍
Diels-Alder反应是一种由共轭双烯和亲双烯体通过单环周的过渡态形成环己烯的一种[4+2]环加成反应。Diels-Alder型加合物是具有环己烯结构的复杂化合物，Diels-Alder型加合物在自然界中大量存在，但其生物合成途径鲜被阐明。桑科植物中含有大量的Diels-Alder加合物，如kuwanonG,kuwanonH,kuwnonJ，chalcomoracin等。其中chalcomoracin被证实具有抗肿瘤、抗炎症等多种药理活性(Zhangetal.,“ThreenewcytotoxicDiels-Alder-typeadductsfromMorusaustralis”.Chemistry&Biodiversity,2007,4(7):1533.)。但是天然桑叶中chalcomoracin含量很低，提取工艺复杂且效率低，又因其复杂的分子结构，化学合成难度大。与此同时，已有学者证明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种紫外诱导桑叶中Diels‑Alderase酶的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取经过紫外光照射后的诱导桑叶，以1:5～1:10g/ml的比例加入pH为6.5～8.0的PBS缓冲液，匀浆后于3～5℃条件下浸提1.5～2.5h，离心得到上清液；步骤2：向步骤1得到的上清液中加入硫酸铵，然后离心收集上清液，向上清液中继续加入硫酸铵，再次离心获得沉淀，将沉淀加入含0.7～0.9M硫酸铵的PBS缓冲液复溶；所述PBS缓冲液复溶pH为7.0～8.0，浓度为50～100mM；步骤3：将步骤2复溶得到的溶液经过疏水性凝胶层析，收集具有Diels‑Alderase酶活性的组分并合并；步骤4：...

【技术特征摘要】
1.一种紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取经过紫外光照射后的诱导桑叶，以1:5～1:10g/ml的比例加入pH为6.5～8.0的PBS缓冲液，匀浆后于3～5℃条件下浸提1.5～2.5h，离心得到上清液；步骤2：向步骤1得到的上清液中加入硫酸铵，然后离心收集上清液，向上清液中继续加入硫酸铵，再次离心获得沉淀，将沉淀加入含0.7～0.9M硫酸铵的PBS缓冲液复溶；所述PBS缓冲液复溶pH为7.0～8.0，浓度为50～100mM；步骤3：将步骤2复溶得到的溶液经过疏水性凝胶层析，收集具有Diels-Alderase酶活性的组分并合并；步骤4：将步骤3中合并后的活性组分经过阴离子离子交换层析，再次收集具有Diels-Alderase酶活性的组分并合并；步骤5：将步骤4中合并后的活性组分经过阳离子离子交换层析，再次收集具有Diels-Alderase酶活性的组分并合并；步骤6：将步骤5中合并后的活性组分进行凝胶过滤层析，最终获得Diels-Alderase酶。2.如权利要求1所述紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法，其特征在于，步骤1中，所述的PBS缓冲液浓度为100mM，离心条件为11000～13000×g离心15～25min。3.如权利要求1所述紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法，其特征在于，步骤1中，所述的诱导桑叶的制备方法具体为：将新鲜采摘的桑叶经紫外光照射，紫外光为UVA波段、UVB波段、UVC波段的一种或多种组合，紫外光照射强度为10～1000W，紫外光照时间为0.05～3h，照射过程中保持湿度在10％～100％；所述的新鲜桑叶优选为4～10月份采摘的新鲜桑叶。4.如权利要求1所述紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法，其特征在于，步骤2中，向步骤1得到的上清液中加入硫酸铵后，需使硫酸铵的饱和度达到40％；向离心后的上清液中继续加入硫酸铵后，需使硫酸铵的饱和度达到60％。5.如权利要求1所述紫外诱导桑叶中Diels-Alderase酶的分离纯化方法，其特征在于，步骤3具体采用如下方法：将步骤2复溶得到的样品上样到预平衡好的phenyl-HP柱上，柱的内径1.6cm，高度12cm，以pH7.5的含有0.8M硫酸铵的浓度为50mM的PBS缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玮，田景奎，虞姣姣，杨丙贤，钟卓珩，刘胜志，管祺杰，张琳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33